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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 立身以立学为先,立学以读书为本课题 3 血红蛋白的提取和分别设计人刘双萍王彦彦审定人张晋成时间 2022. 4 12 学习目标 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分别,使同学能够体验从 复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法,并明白色谱法、电泳法等 分别生物大分子的基本原理,为今后学习运用这些技术打下基础；学习重难点：凝胶色谱法的原理和方法；课题重点：凝胶色谱法的原理和方法；自主学习凝胶色谱法（安排色谱法）：1、概念：依据被分别蛋白质的,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,来分别蛋白质的有效方法；2 原 理：当 不 同 的 蛋 白 质 通
2、 过 凝 胶 时,相 对的蛋 白质简单进入 凝胶内部 的通道,路程,移动速度,而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在 移动,路程,移动速度,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分别；3、详细过程：A. 的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内在部而被滞留；的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面,了里之间快速通过；B. （1）混合物上柱；的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；（2）洗脱开头,的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动；（4）不同的蛋白质分子完全分开；中洗脱（5）的蛋白质行程较短,已从出来,的蛋白质仍在行进中；缓冲溶液：1、概念： 在肯定的范畴内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不
3、引起溶液 PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液；名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 立身以立学为先,立学以读书为本2 、作用：能够抵制 的对溶液的的影响,维护 PH基本不变；3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成；调剂缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液；摸索：说出人体血液中缓冲对？摸索：在血红蛋白整个试验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模拟细胞内的 PH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观看 （红色） 和材料的科学讨论（活性）电泳：1
4、、概念：指 发生迁移的过程；2、原理：很多重要的生物大分子,如 等都具有在 下,这些基团会带上；在电场的作用下,这些带电分子会向着与其移动；电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的,从而实现样品中各种分子的分别；二 试验操作蛋白质的提取和分别一般分为四步：样品处理粗分别纯化纯度鉴定1. 样品处理 1 红细胞的洗涤目的：去除方法：离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分别的成效）,然后用胶头吸管吸出上层透明的,将下层 的红细胞液体倒入再加入用 的 质量分数为 0.9 的氯化钠溶液洗涤低速离心（低速短时间）重复 4、5 步骤次,直至上清液中已没有
5、,说明洗涤洁净；利于后续血红蛋白的分别纯化,不行洗涤次数过少；2 血红蛋白的释放名师归纳总结 加到体积,再加40体积第 2 页,共 4 页的溶解细胞膜）,置于上充分搅拌 10 分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. 2000r/min3 分别血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内,以的速度离心10 min ,试管中的溶液分为4 层: - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 立身以立学为先,立学以读书为本第 1 层（最上层）：甲苯层第 2 层（中上层）：的沉淀层,色薄层固体第 3 层（中下层）：的水溶液层,第 4 层（最下层）：其它杂质的沉淀层4
6、 透析2. 凝胶色谱制作1）凝胶色谱柱的制作取长 40 厘米,内径1.6 厘米的玻璃管,两端需用砂纸磨平；底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部掩盖尼龙网,再用100 目尼龙纱包好；顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体；安装其他附属结构；2）凝胶色谱柱填料的处理（1）凝胶的挑选：；（2）方法：配置凝胶悬浮液：运算并称取肯定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀后,配成；（3）凝胶色谱柱的装填方法 固定：将色谱柱处置固定在支架上 装 填 ： 将 一 次 性 的 缓 慢 倒 入内,装填时轻小扣动色谱柱,使凝胶填装匀称；洗涤平稳装填完毕后, 立刻用缓冲液洗脱瓶,在 高的操
7、作压下, 用 300ml的 20mmol/l 的磷酸缓冲液（pH为 7.0 ）充分 12 小时；3）样品加入与洗脱（1）加样前： 打开下端出口, 使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐,关闭出口（2）加透析样品调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用将 1ml 的样品加到色谱柱的样品渗入凝胶床：洗脱：打开下端,用磷酸缓冲液洗脱收集：待 接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每 收集一试管连续收集课堂练习名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 立身以立学为先,立学以读书为本1. 用凝胶色谱法分别蛋白质时,分子量大的蛋白质 A
8、路程较长,移动速度较慢 B路程较长,移动速度较快 C路程较短,移动速度较慢 D路程较短,移动速度较快2. 蛋白质提取和分别分为哪几步 A样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C样品处理、粗分别、纯化、纯度鉴定 D样品处理、纯化、粗分别、纯度鉴定 3. 在血红蛋白的整个提取过程中,不断用磷酸缓冲液处理的目的是 A磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 B血红蛋白是一种两性物质,需要酸中和 C防止血红蛋白被 02氧化D让血红蛋白处在稳固的pH范畴内,维护其结构和功能4在盛有红褐色的 FeOH3,胶体的 U形管的两个管口,各插一个电极,通直流电后,发觉阴极邻近的颜色逐步加深,这说明 A FeOH3胶体粒子带正电荷,向阴极移动 B FeOH3胶体粒子带负电荷,向阳极移动 C FeOH3胶体粒子带正电荷,向阳极移动 D FeOH3胶体粒子带负电荷,向阴极移动5. 样品的加入和洗脱的操作不正确选项（） A. 加样前,打开色谱柱下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B. 加样后,打开下端出口,使样品渗入凝胶床内 C. 等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口 D. 用吸管当心的将 面1ml 透析后的样品加到色谱柱的顶端,不要破坏凝胶名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 4 页