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1、-作者xxxx-日期xxxx血红蛋白的提取和分离学案【精品文档】血红蛋白的提取和分离学案张建尚 江苏省赣榆高级中学【学习目标】1.尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。2.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。【重点和难点】重点: 凝胶色谱法的原理和方法。难点: 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。【课前预习】1.不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。1.较小较长
2、较慢较大凝胶外部较短较快2.在一定范围内，缓冲溶液抵制外界的 对溶液pH的影响，维持pH 。电泳是利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。2.酸或碱基本不变带电性质的差异大小形状迁移速度3.采用 的方法分离红细胞。红细胞洗涤的目的是 ，以利于后续步骤的分离纯化。在洗涤好的红细胞中加入 ，充分搅拌后红细胞破裂，释放出血红蛋白。血红蛋白溶液经离心后，明显分为4层，从上到下的主要成分分别是 。对血红蛋白溶液进行透析的目的是去除 。3.低速短离心去除杂蛋白蒸馏水和甲苯甲苯、脂溶性物质、血红蛋白和沉淀物分子量较小的杂质4.制作凝胶色谱
3、柱的材料有 。 装填凝胶色谱柱的材料是 ，装填时要缓慢倒人色谱柱内，不能有 存在。装填完后，用20mmol/L的 充分洗涤平衡凝胶12h。加样时用吸管小心地将1mL透析后的样品加到 的顶端，注意不要破坏 。4.玻璃管、橡皮塞、移液管、尼龙纱、尼龙网凝胶一次性气泡磷酸缓冲液凝胶色谱柱的顶端凝胶面【课堂探究】一、基础知识1.下图是凝胶色谱法分离蛋白质的原理，据图分析：凝胶颗粒蛋白质a蛋白质bA（1）（2）（3）（4）（5）B多孔板（1）图A中蛋白质a能进入凝胶颗粒内部而蛋白质b被排阻在凝胶颗粒外面的原因是 。所以蛋白质 在图B中的路程就短，移动速度 ，当它从凝胶柱中洗脱出来时，蛋白质 还在行进中。
4、（2）除了上述原理外，还可以利用哪些原理分离蛋白质？ 。一、1.（1）蛋白质a的相对分子质量较小，蛋白质b的相对分子质量较大b较快a（2）蛋白质的形状、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力2.人体血浆中的H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等的作用是 ，体内细胞或物质在体外是否需要与体内一样的环境条件才能保持原有的生物活性？ 。怎样使其保持与体内一样的酸碱度呢？ 。2.缓冲酸和碱对血浆pH的影响，维持血浆pH基本不变是利用配制的缓冲溶液模拟体内的pH环境3.电泳时，带正电和负电的蛋白质在电场中的迁移方向是 ；若蛋白质的带电性质和数量相同，但蛋白质的分子
5、大小不同，则蛋白质在电场中的迁移情况是 。叶绿体色素分离使用的支持物是 ，电泳分离蛋白质使用的支持物是 。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于 。3.带正电的蛋白质向阴极迁移，带负电的蛋白质向阳极迁移向同一极迁移，但分子大迁移慢，分子小的迁移快滤纸凝胶分子的大小二、实验操作1.分析与样品处理有关的问题：（1）分离红细胞离心速度不能过高和时间过长的原因是 。洗涤红细胞的目的是 。用生理盐水洗涤红细胞的原因是 。洗涤次数不能过少的原因是 。洗涤成功的标志是 。（2）在红细胞液中加入蒸馏水的目的是 ，甲苯的作用是 ，充分搅拌的目的是 。透析袋AB（3）将血红蛋白从混合液中分离出来所使用的方法
6、是 。右图是分离结果示意图，图中的物理性质分别是 ，主要成分分别是 。将血红蛋白从中分离出来要经过 过滤和 分离两步。（4）右图装置用于 ，其目的是 。若B是血红蛋白溶液，则A是 。1.（1）离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离效果去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化生理盐水是等渗溶液，能够维持红细胞正常的形态洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白上清液中没有黄色（2）让红细胞吸水胀破瓦解细胞膜加速红细胞破裂（3）离心无色透明液体、白色薄层固体、红色透明液体、暗红色沉淀物甲苯、脂溶性物质、血红蛋白、红细胞破碎物滤纸分液漏斗（4）血红蛋白的粗分离除去样品中分子量较小的杂质20mol/L
7、的磷酸缓冲液打孔安装玻璃管挖出凹穴a b c d e f2.以下是凝胶色谱柱的制作过程图解，正确的顺序是 。2.aebdcf3.右图是装填的凝胶色谱柱，据图分析：aSephadexG-75（1）图中“G”表示 ，75表示 。加入前需放在洗脱液中膨胀，为了加速膨胀，可用沸水浴加热，这样不但可以节约时间，而且可以 。（2）装填凝胶时要先打开a ，然后一次性倒入并轻轻敲动色谱柱，目的是 。装填过程中若发现有气泡存在，必须重装，因为气泡会 ，降低分离效果。（3）装填完后，为了使凝胶装填紧密，还需使用 充分洗涤平衡凝胶12h。该过程中出现何种现象需要重新装填凝胶色谱柱？ 。3.（1）凝胶的交联程度，膨胀
8、程度及分离范围凝胶得水值除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气（2）螺旋夹使凝胶装填均匀搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序（3）20mmol/L的磷酸缓冲液洗脱液流干，露出凝胶颗粒 a b c d样品样品A B操作压e4.下图A是样品的加入示意图，图B是洗脱示意图。（1）加样前需先让凝胶面上的缓冲液下降至与凝胶面平齐，操作方法是 。加样时正确的操作次序是 。（2）洗脱液e是 ，洗脱时要打开 ，待 接近色谱柱底端时，用试管收集流出液。（3）如何确定色谱柱的制作是成功的？ 。5.（1）打开色谱柱下端的流出口bcad（2）20mmol/L的磷酸缓冲液色谱柱下端的流出口红色的蛋白质（1）红色区带均匀一
9、致地移动【课堂巩固】1.下列有关血红蛋白提取和分离实验的叙述错误的是（ ）B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C.通过凝胶色谱法可除去杂质蛋白，即样品的纯化D.可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度1.B【解析】血红蛋白提取和分离的程序可以分为四大步，即样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，此为样品的处理，A项正确；再经过透析去除分子量较小的杂质，此为样品的粗分离，B项错误；通过凝胶色谱法将相对分子质量大于或小于血红蛋白的杂质蛋白除去，此为样品的纯化，C项正确；经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，D
10、项正确。acbd 2.凝胶色谱法是一种快速而又简单的分离技术，请据图回答相关问题：（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是 。（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代。（3）凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗? 。图中a和b的分离度与凝胶色谱柱的高度有关吗? 。（4）在哪些情况下需要重装凝胶色谱柱？ 。（5）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。（6）对样品进行粗分离的方法是 ，纯化的方法是 。判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯化的鉴定。在鉴定的方法中使用最多的是 凝胶电泳。2.（1）a；a相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快（2）尼龙网和尼龙纱（3）不影响（4）有关（4）产生气泡、洗脱液流干，露出凝胶颗粒（5）相同；保持稳定（6）透析；凝胶色谱法；SDS-聚丙烯酰胺【精品文档】