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1、感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南前言感染性疾病是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病，快速、准确的诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着分子检测技术的不断发展和完善，分子检测在病原微生物感染诊断及治疗监测上的临床应用日益广泛，已成为一些重要的感染性疾病的诊断和疗效评价中不可缺少的重要工具。为使我国的感染性疾病分子检测临床应用健康有序发展，更好的为医患提供高质量的服务，有必要制订感染性疾病相关的分子检测技术指南，规范临床实验室相关分子检测操作程序，指导从事感染性疾病分子诊断的医务人员正确开展工作。本指南以大量、丰富的临床实践为基础，同时消化吸取了大量国内外文献的精华，广泛征
2、求相关学科专家的意见，遵循科学性、实用性、可行性的原则，反复修改而成。我们衷心希望感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南能够对广大检验人员起到很好的帮助和指导作用，从而为提高感染性疾病临床诊治水平发挥积极的作用本指南起草单位：中国医科大学附属第一医院、国家卫生计生委临床检验中心本指南起草人：尚红、李金明、郭晓临、代娣、程仕彤目录1. 本指南适用范围32. 标准术语33. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测概述94. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析前质量控制124.1 标本采集134.2 标本的转运164.3 标本的接收174.4 标本的保存184.5 检验项目的选择195. 感染性疾
3、病相关的个体化医学分子检测分析中质量控制205.1 实验室的设计要求205.2常用的分子检测方法215.3 试剂和方法的选择295.4 设备维护和校准365.5 人员培训365.6 试剂性能验证376. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测分析后质量控制406.1 结果报告406.2 结果的解释及医患的沟通416.3 检测后标本的保存及处理427. 质量保证427.1 标准操作程序427.2 质控品427.3 室内质量控制437.4 室间质量评价478. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测应用488.1 乙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测488.2 丙型肝炎病毒感染诊疗的个体化分子检测528.
4、3 结核分枝杆菌感染诊疗的个体化分子检测568.4 人获得性免疫缺陷病毒感染诊疗的个体化分子检测57附录65参考文献661. 本指南适用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会编订，是国家卫生计生委个体化医学检测技术系列指南之一，旨为临床实验室进行感染性疾病相关的个体化医学分子检测提供参考和指导。本指南介绍了感染性疾病相关的个体化医学分子检测应注意的相关问题、技术方法、结果报告与解释、质量保证及临床应用等内容。本指南主要适用于开展个体化医学分子检测的医疗机构临床检验实验室，同时供从事感染性疾病诊治的临床医师参考。2. 标准术语2.1 感染性疾病（infectious diseas
5、e）即由病原微生物引起的疾病的统称。2.2 病原微生物（pathogen）指侵犯人体，引起感染的微生物，或称病原体。病原微生物包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫和朊毒体。2.3 宿主（host）为病原体提供生存环境的生物，本指南中的“宿主”仅指人体。2.4 窗口期（window period）宿主感染病原体，需要一段时间之后才能产生抗体。从感染病原体到能检测到抗体的时间就叫做窗口期。2.5 扩增子扩增产物（amplicon/amplification product）由目标扩增反应产生的相对低分子量的产物。2.6 质控品（control）为质量控制目的而制备的标本称
6、为质控品。质控品不能用于校准。质控品的性能指标有:稳定性、瓶间差、定值和非定值、分析物水平、预处理的要求等。2.7 标准品（standard）用于定标，即标准曲线的绘制。2.8 校准品（calibrator）指定用来校准某检测系统（仪器+试剂+方法程序）的，是在考虑到基质效应的情况下，人为赋予校准品的校准值。因此，校准品必须专用于某一检测系统。2.9 抑制作用（inhibition）临床标本中的某些成分或者标本采集和处理过程中引入的某些外源性物质可能对扩增反应或者识别过程产生的削弱作用。2.10 内部质控（internal control）在同一个反应管中存在的一段非目标序列，将与目标序列一同
7、被扩增，用于识别由温控故障、不合格的试剂或聚合酶活性等造成的抑制作用，以及识别相同的基质内是否存在抑制性物质。2.11 核酸酶（nuclease）能够水解核酸的多种酶中的任何一种，比如内切酶和外切酶。2.12 核酸提取（nucleic acid extraction）将核酸（RNA，DNA）从生物物质中分离出来的过程，以备进行核酸的扩增和分析。2.13 检验（examination）以确定一个特性的值或特征为目的的一组操作。实验室检验也常称为检测或试验。确定一个特性的值的实验室检验称为定量检验，确定一个特性的特征的实验室检验称定性检验。2.14 原始样品（primary sample）标本（s
8、pecimen）为检验、研究或分析一种或多种量或特性而取出的认为可代表整体的一独立部分的体液、呼出气、毛发或组织等。2.15 样品（sample）取自原始样品的一部分或多部分。2.16 寡核苷酸（Oligonucleotide）一种短分子单链DNA，通常为6-100个核苷酸，由化学方式合成。2.17 引物（Primer）一个寡核苷酸，可以与目标DNA的互补链杂交。在DNA聚合酶和核苷酸的参与下，启动DNA的合成过程（从3-OH 端开始）。2.18 探针（Probe）已定义的单链核酸片段，用于识别特定的包含其互补序列的DNA或者RNA分子。探针通常都附带一个标记（放射性标记或者化学性标记），使探
9、针在杂交后能被检测到。2.19 淬灭剂（Quencher）能够从荧光基团接收能量并且通过近端淬灭或者FRET淬灭来消耗该能量的分子。2.20 野生型（wild type）基因或生物体在自然界中常见的或非突变型的形式。2.21 突变（mutation）基因的结构发生改变而导致细胞、病毒或微生物的基因型发生稳定的、可遗传的变化过程。2.22 点突变（point mutation）基因内单个核苷酸置换所造成的结构改变。2.23 缺失突变（deletion mutation）由于相邻的多个核苷酸或片段丢失所造成的突变。2.24 杂合子（heterozygote）又称“杂合体”。在二倍体生物中，一对同源
10、染色体上特定的基因座上有两个不同的等位基因的个体或细胞。2.25 纯合子（homozygote）又称“纯合体”。在二倍体生物中，一对同源染色体上特定的基因座上有两个相同的等位基因的个体或细胞。2.26 表型（phenotype）一个生物体（或细胞）可以观察到的性状或特征，是特定的基因型和环境相互作用的结果。2.27 基因型（genetype）一个生物体或细胞的特定基因组成。2.28 单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms, SNPs）是指由单个核苷酸A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。2.29 随
11、机误差（random error）在重复测量中按不可预见方式变化的测量误差的分量。通常随机误差的参考量值是对同一被测量多次重复测量得到的均值。2.30 系统误差（systematic error）在重复测量中保持不变或按可预见方式变化的测量误差的分量。系统误差的参考量值是真值,或者是测量不确定度可忽略不计的测量标准测得的值,还可以约定量值。2.31 验证（verification）通过提供客观证据证实对规定要求已得到满足的认定。验证过程证实的检验程序的性能指标,应与检验结果的预期用途相关。2.32 确认（validation）通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定。性能确认
12、应尽可能全面,并通过客观的证据(以性能特征形式) 证实满足检验预期用途的特定要求。2.33 精密度（precision）在规定条件下，对同一或类似被测对象重复测量所得示值或测得值间的一致程度。规定条件可以是重复性测量条件、期间精密度测量条件或复现性测量条件。精密度通常无法衡量，而以不精密度表达，常用标准差、方差或变异系数表示，是对随机误差的衡量。2.34 正确度（trueness）多次重复检测所得量值的平均值与一个参考量值间的一致程度。通常用“偏倚”表达，是对系统误差的衡量。选择一个合适的参考对正确度评价很重要，最好采用参考方法。2.35 可报告范围（reportable range）指测量仪
13、器的误差在预期规定范围内的被测量值的集合。2.36 测量范围（measurement range）检测方法可直接对未经稀释、浓缩或其他非常规检测流程预处理的标本进行检测，得到的分析物浓度范围。2.37 临床可报告范围（clinically reportable range）通过采用标本的稀释、浓缩或其他预期处理，用于延长直接的分析测量范围下的分析物值的范围，其范围一般较测量范围宽，是考虑方法检测限和预处理流程后的测量范围的延伸。2.38 参考区间（reference interval）又称为参考范围、正常范围等，通常采用参考值分布的中间95%区间。2.39 检测限（limit of detec
14、tion, LoD）指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。2.40 干扰（interference）指被测物质浓度因样品特性或其他成分的影响而出现的临床显著性偏差，评价的是由样品引起的特异性偏差。2.41 敏感性（sensitivity）指金标准诊断有病的全部病例中，被评价方法结果为阳性的病例占全部有病病例的比例，即敏感性=真阳性/(真阳性+假阴性) 100%。2.42 特异性（specificity）指金标准诊断全部无病病例中，被评价检验方法结果为阴性的病例所占全部无病病例的比例，即特异性=真阴性/(假阳性+真阴性) 100%。2.43 生物学变异（ b
15、iological variation）指在机体稳定状态下，排除已知可能影响因素（例如，疾病、用药、禁食、运动等），除外已知节律性变化（例如，对于某些检验项目，昼夜或季节性变化等），依然存在的随机变异。2.44 分析前变异（pre-analytical variation）从患者准备开始至样品分析启动前各环节造成的变异，包括抽血及有关条件、运输、离心、保存等环节或因素造成的变异。2.45 检验前过程（pre-examination processes）分析前阶段（preanalytical phase）按时间顺序从医生申请至分析检验启动前的过程，包括检验申请、患者准备和识别、原始样品采集、运送
16、和实验室内运送等。2.46 检验后过程（post-examination processes）分析后阶段（postanalytical phase）包括结果复核、临床材料保留和储存、样品和废物处理，以及检验结果的格式化、发布、报告和留存等。3. 感染性疾病相关的个体化医学分子检测概述感染性疾病是由病原微生物（细菌、病毒、真菌、寄生虫等）引起的疾病的统称。据统计感染性疾病死因占全部死因的25%以上，是当今世界严重威胁人类健康的重大疾病。3.1 分子检测与感染性疾病的个体化医疗 个体化医疗（personalized medicine）是以每个患者的信息为基础来决定治疗方案，从基因组成或表达变化的差
17、异来把握治疗效果或毒副作用等应答特异性，对每个患者进行最适宜的治疗。个体化医疗目前在个体化用药、疾病诊断、治疗监测以及预后判断中都发挥着重要作用。长期以来感染性疾病的诊断和疗效监测一直依靠形态学、免疫学以及病原体分离培养和药敏试验等方法，但形态学检验受检测人员经验影响较大，易误诊；而免疫学、药敏试验和病原体分离培养的窗口期或检测实验周期较长，易错过最佳治疗时机。分子检测在病原体检测中优势明显，灵敏度高、特异性强、快速准确。因此近年来发展较快，已成为病原体诊治中不可或缺的重要工具，而且已经广泛应用于感染性疾病的个体化诊断和治疗中。例如利用分子检测技术可以帮助明确乙型肝炎患者体内HBV DNA的病
18、毒载量、基因型和基因突变情况，而这些正是判断患者何时开始治疗、采用何种治疗方案、发生肝硬化等不良预后风险的决定性因素。3.2 个体化医学分子检测在感染性疾病中的应用 本指南中涉及的感染性疾病个体化医学分子检测主要包括病原体核酸定量检测、分子分型检测、耐药基因检测及与疗效相关宿主基因型检测。3.2.1 病原体核酸定量（载量）检测 病原体核酸定量检测有助于评估疾病阶段及严重程度，指导临床合理用药，观察疗效，监测疾病进程以及判断疾病预后。例如HCV RNA检测是判断HCV有无现症感染的证据；其病毒载量的高低与患者的长期预后如肝硬化和肝癌的发生相关，是进行抗病毒治疗的基础，同时还是应用抗病毒治疗过程中
19、耐药监测的最重要指标。应根据抗病毒治疗的早期病毒学应答情况来调整治疗方案，以提高疗效，降低耐药发生率。3.2.2 病原体分子分型检测 由于不同型别病原体具有迥异的致病性和药物敏感性，因此病原体分子分型检测有助于指导临床合理治疗以及判断疾病预后。例如HCV分为6个基因型和80多种基因亚型，不同基因型患者的病毒学应答率差距明显，如2、3及6型患者较易获得持续病毒学应答（SVR），而1和4型应答较差，属于难治性丙型肝炎，其利巴韦林的用药剂量和用药时间有显著差别。因此在采用传统方法治疗前须进行HCV基因型检测，以便决定治疗方案。目前，丙肝的临床治疗已取得重大进展，一些小分子药物对丙肝病毒无基因型要求，
20、并且临床治愈率很高。宫颈癌早期症状不明显，发展过程中存在较长的、可逆转的癌前病变期。从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间。如能在癌前病变阶段进行医学干预，宫颈癌治愈率可达98%。多中心研究表明，我国宫颈癌及宫颈高危病变以感染HPV16和18型为主，约85%左右的宫颈癌确诊病例属于这两种类型，且HPV16/18型的感染率和致癌率都明显高于其他高危HPV型别。因此对高风险人群进行HPV16/18等高危型筛查有助于宫颈癌的防治。3.2.3 病原体耐药基因检测所有产生耐药的病原体，不论其产生的机制如何，均与病原体基因位点突变有关，因此进行病原体耐药基因检测有助于早期指导临床合理用药，控制
21、耐药病原体的流行。例如结核分枝杆菌对利福平耐药与ropB位点突变有关；肠球菌对糖肽类抗生素的耐药基因由Van A、Van B、Van C等介导，测定这些基因可以预测对万古霉素和壁霉素的耐药性。因此，应根据耐药基因突变情况来调整治疗方案，以提高疗效，避免耐药发生。3.2.4 与疗效相关的宿主基因型检测宿主基因多态性可能对病原体的清除和治疗产生影响。研究发现，IL28B的单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism, SNP）与抗HCV疗效密切相关，IL28B的基因型有助于临床疗效预测，确定慢性丙型肝炎患者的个体化治疗方案，使病人获得最大的收益。3.3 分子检测在感
22、染性疾病个体化医疗应用中的局限性综上所述，个体化医学分子检测已日益广泛地应用于感染性疾病的诊治过程，并取得了显著成效。然而，在目前的临床实验室应用中，应注意以下几点：影响分子检测准确性的因素很多，如实验室污染或是标本间交叉污染可导致假阳性结果，扩增抑制物或是标本处理不充分可能导致假阴性的结果等。因此，必须建立规范化实验室质量控制体系和标准操作程序，并严格按照要求进行检测。尽管其具有敏感性高、特异性好等优点，但其本身还有许多方面有待进一步完善。如单次的分子检测不能判断是否为活的病原体；受多种因素影响，基因型耐药和表型耐药可能存在差异等。因此当我们选择分子检测方法时，必须基于该种检测结果的临床价值
23、，需考虑结合其他检测项目或检测方法综合判断结果。感染性疾病的临床诊治常是极其错综复杂的，仅依靠一项或几项实验室检查还不够，详细的病史询问，细致的体格检查等综合分析是极为重要的。4. 分析前质量控制分子检测分析前质量控制包括填写正确完整的检验申请单，合理规范的标本采集，适当的标本转运周期和转运条件，以及适宜的标本预处理和分析前标本保存等。感染性疾病个体化分子检测通常检测的是病原体的核酸，其浓度、稳定性和完整性对检验结果有决定性影响，因此为得到可靠和准确的检验结果，有必要规范分析前质量控制的各项程序。病原微生物核酸检测不同于其他分子检测，有其自身的特点，在分析前阶段主要包括：病原微生物核酸不仅存在
24、于血液、脑脊液等体液中，还存在于尿液、粪便等排泄物中，因此影响核酸纯化的干扰物质（如血红素、尿素、pH值等）较多。病原微生物核酸受病原微生物生命周期、复制环境和患者用药等情况的影响，所以要根据检验目的正确选择检验项目、标本采集时间和标本采集类型等。标本采集和转运容器、标本转运和储存条件以及标本处理方法等都会直接影响病原微生物核酸检测。标本采集、转运及储存需按照血源性病原体职业接触防护导则、病原微生物实验室管理条例和实验室生物安全通用要求等相关生物安全要求进行操作。鉴于病原微生物分子检测的特殊性，有如下建议：4.1 正确、规范的标本采集 感染性疾病是临床的常见病，重症感染有较高的病死率。正确的标
25、本采集对感染的早期诊断和有效治疗等有重要的临床意义。4.1.1 标本采集原则 详见个体化医学检测质量保证指南，但在感染性疾病个体化医学检测中尤其需注意以下几点：采集标本时应使用严格的无菌技术，将污染的可能性降至最低；标本采集时间由检测目的决定，如在感染的急性期，应在使用抗生素或伤口局部治疗前采集标本进行基线检测，再根据治疗时间和循环病原微生物半衰期等确定再次采样时间；在患者使用抗感染治疗前，应在发热初期或高峰期或发热前半小时采集标本，对已使用抗感染治疗而又不能停药的患者，应重复采集标本数次以提高检出率；采取适当的解剖位置和技术，防止标本溶血等影响检测结果的准确性；正确选择采集/储存容器，例如检
26、测的病原微生物为RNA病毒（如HCV、HIV等），由于RNA易受RNA 酶的降解, 须使用经高压灭菌或经RNase酶清除处理过的无RNase酶的一次性耗材。4.1.2 确定正确的标本量 为避免因病原体核酸浓度过低造成假阴性结果，应根据检验目的和检验方法的要求采集足够量的标本。例如利用支气管肺泡灌洗液进行结核分枝杆菌核酸检测时，至少要留取1ml支气管肺泡灌洗液。4.1.3 常用标本类型 常用标本包括血浆、血清、全血、支气管肺泡灌洗液、骨髓、脑脊液、培养的细胞、培养的菌株、尿液、痰液、拭子、尿液、乳汁等。为避免标本中核酸的降解，保证核酸的完整性和检测的准确性，对每种标本的采集有以下建议，但具体要求
27、由临床需求和检测目的决定：4.1.3.1 血液标本 肝素是Taq 酶的强抑制剂，全血和血浆标本宜选择乙二胺四乙酸（EDTA）或枸橼酸（ACD）盐作为抗凝剂。鉴于注射器采血易导致溶血，建议采用真空负压采血管采集血液标本；采用带有促凝剂的真空负压采血管采集血清标本。4.1.3.2 呼吸系统标本 痰液标本应以清晨第一口痰为宜，患者晨起用清水漱口数次，用力咳出深部痰液，混有血液为不合格样品。留取至少1ml于无菌可密封标本盒中。痰量少者可采用加温45左右的10%氯化钠溶液雾化吸入，使痰液容易排出。咽拭子应用棉拭子采集患者咽后壁或悬雍垂的后侧，反复涂抹数次。鼻咽拭子应经鼻腔进入鼻咽部采集标本，置于运送培养
28、基中送检；鼻咽管应用细鼻饲管从鼻腔进入到鼻咽部，用负压吸引器吸取鼻咽部分泌物并放入无菌容器内送检。支气管肺泡灌洗液应留取至少1ml于无菌可密封试管中。4.1.3.3 泌尿生殖系统标本 尿液标本：建议采集浓缩晨尿，至少10ml于无菌可密封试管中。应考虑尿量、距上次排尿的时间、感染等因素对结果的影响。在应用抗感染治疗前或停药1-2天后采集标本，最好采集清晨第一次尿液或者采集在膀胱内贮留6-8小时的尿液。可采用中段尿液采集法、导尿采集法、膀胱穿刺法。宫颈和尿道拭子标本：男性尿道标本采用涤纶拭子，女性宫颈和阴道标本采用人造纤维或涤纶拭子，并放入适当的基质液中。用于支原体分子检测, 取材时一定要取到上皮
29、细胞（沙眼衣原体在活细胞内才能增殖复制），而只取分泌物会降低检出率。宿主细胞DNA比例、其他微生物、分泌物的量等可能会直接影响分子检测结果。4.1.3.4 其他体液标本 胸腹水标本：首次穿刺抽到积液后，应弃掉第一管标本及所用注射器，然后更换新的一次性注射器抽取。穿刺采集后留取中段液体于带盖的无菌试管内，因积液易凝集，应采用EDTA抗凝，同时注意防止外伤性血液的进入。乳汁标本：留取至少10ml。粪便标本：留取有粘液或其他特征性粪便标本于无菌可密封标本盒中，不能混有尿液。脑脊液标本：建议在留取化学和免疫学、细菌学、以及一般性状等检查标本后，留取至少1ml脑脊液于无菌可密封试管中，以避免皮肤病菌污染
30、和混入血液致溶血而影响检测结果。组织标本：浅表、开放性脓庖和创口应清创后,使用拭子涂抹创口；蜂窝织炎和丹毒应使用穿刺针抽吸组织取样；复杂性皮肤软组织感染使用组织活检、穿刺针抽吸、外科手术等方法取深层组织进行检测。4.1.3.5 培养的细胞或菌株/毒株 在提取前最好放在37或其适宜生长的温度或环境中；并严格按照相关生物安全要求进行操作。4.2 标本的转运4.2.1 标本转运原则 详见个体化医学检测质量保证指南，但在感染性疾病个体化医学检测中尤其需注意以下几点：按照国家病原微生物实验室生物安全管理条例进行相应病原微生物标本的运输，如已知为HIV阳性标本需由经过相关培训并具有相应资质的人员使用WHO
31、三级包装系统的容器运输。如条件允许，建议尽快将标本转运至实验室进行预处理或保存。根据检验的靶基因和处理前时间决定转运条件，如脑脊液标本用于DNA检测时应2-8转运，用于RNA检测时应立即冰上转运。采用适当的转运方式和容器，以避免标本污染，如采血管可采用气动传送转运，但粪便标本建议采用人工转运。实验室应评估标本容器，确保其不会对所进行的分析造成任何干扰。4.2.2 常见类型标本转运要求4.2.2.1 血液标本 全血标本：如转运时间在24小时内可室温转运，在2472小时内则2-8转运；冻存样本需用干冰转运。血浆、血清标本：建议2-8转运；冻存样本需用干冰转运。4.2.2.2 脑脊液、胸腹水、支气管
32、肺泡灌洗液标本 用于DNA检测的样本，应2-8转运；用于RNA检测的样本，应立即冰上转运；冻存样本需用干冰转运。4.2.2.3 尿液、乳汁、粪便、宫颈和尿道拭子标本 应尽快转运，如环境温度25，建议2-8转运。4.2.2.4 痰液标本 用于DNA检测的标本，如在30分钟内不能转运至实验室，建议2-8转运。4.2.2.5 培养的细胞或菌株/毒株 最好放在37或其适宜生长的温度或环境中转运；注意按照相关生物安全要求进行操作。4.3 标本的接收4.3.1 不合格标本判断标准4.3.1.1 通用标准 标本信息不正确、不完整（必要时应包括详尽的临床信息和采集部位，以便于准确地进行临床解释）、标本类型或标
33、本容器与检验目的不符、标本量过少/过多、无采集时间、标本有明显的污染迹象（如已溢洒）、标本采集后超过预处理时间送检等。4.3.1.2 不合格标本判断标准 血液标本溶血、乳糜、严重黄疸等；体液标本混有血液；痰标本为褐色血痰或含有少量新鲜血液的血痰、唾液标本（透明或半透明水样、粘度较低、有时伴有气泡）；固体培养物培养在非适当的固体培养基、菌苔较少；液体培养物菌液浓度小于1个麦氏浊度等。4.3.2 让步检验标本的接收标准 对于样本量较少，能满足检验用量但不足样本保存量的，且患者重新采样存在困难的，与临床科室沟通后予以接收。对于样本有轻微乳糜或溶血，患者重新采样存在困难或由于药物等影响再次采样仍会存在
34、乳糜或溶血的，经与临床科室沟通坚持检验的，予以接收，记录至当日的工作日志，并在发送的检验报告的备注中注明样本情况。 当标本标识不清或不全，但标本再获取困难或原始标本中需检测的核酸不稳定，可先接收标本，待项目申请医师或标本采集人员识别了标本信息，提供适当的信息并确定标本所对应的患者后再发送检验结果报告。4.4 标本的保存4.4.1 标本保存的原则 详见个体化医学检测质量保证指南，但在感染性疾病个体化医学检测中尤其需注意以下几点：为保证核酸的完整性和稳定性，选择适宜的温度保存。不能使用无霜冰箱保存标本，要记录冰箱温度，如有条件可安装冷链系统监测冰箱温度。使用适宜的容器保存标本和预处理后的样本，如血
35、浆在有分离胶的采血管中冻存后会使HIV-1病毒载量检测值假性升高，因此需离心分离出血浆后，转移至无RNase酶的可密封容器中保存。反复冻融会降解核酸，因此避免反复冻融。如果有条件，在用于RNA检测的标本采样器中加入RNA稳定剂冻存。DNA在TE（Tris-EDTA）中会更稳定，室温可保存26周，2-81年，-207年，-707年。保存病原微生物标本的冰箱需双人双锁，取用具有高致病性病原微生物标本需申报，经审批后按相应生物安全要求操作。4.4.2 常见类型标本保存条件4.4.2.1血液标本 全血标本：室温可保存24小时，保存2-8时应在72小时内提取DNA；建议在去除红细胞后，-20或-70长期
36、保存。血浆、血清标本：如果4小时内不能提取RNA，应-70保存血浆。建议-20或-70长期保存。4.4.2.2 呼吸系统标本 痰液标本：如不能立即检测应在-70保存。用于分枝杆菌分子检测需液化后保存。支气管肺泡灌洗液标本：如果24小时内不能检测，2-8可保存72小时，如近期不能检测应在-70保存。如进行分枝杆菌检测，应在液化后保存。4.4.2.3 其他体液标本 脑脊液、胸腹水标本：用于DNA检测的样本，如不能立即检测应在-20或-70保存。用于RNA检测的样本，应在1-4小时内提取；如近期不能检测，应在去除红细胞后立即冻存。宫颈和尿道拭子标本：用于DNA检测的样本2-8保存10天。尿液、乳汁、
37、粪便标本：建议采集后保存在2-8，并尽快提取核酸。4.4.2.4 培养的细胞或菌株/毒株 在检测前最好放在37或其适宜生长的温度或环境中，注意按照相关生物安全要求进行操作。4.5 正确选择检验项目 根据检验目的合理选择，包括根据患者的诊治情况正确选择各检验项目的检测时机和频次，根据临床意义选择正确的标本类型，根据不同标本情况正确选择检测方法、判断检测结果等。4.5.1 正确选择检测时机和频次 一般情况下，病原体核酸定量检测应根据病原体感染的自然史，在进行用药指导、治疗或者疗效预测时进行检测。例如HBV DNA定量检测应在抗病毒治疗前进行基线检测，再根据治疗效果的不同，每3个月或6个月进行随访检
38、测。病原体基因型和耐药基因检测，通常在进行用药指导、治疗或者病原体核酸数量反弹时进行检测，一般检测一次即可，但如果存在再次感染或更换治疗方案时，可能需要再次进行检测。与疗效相关的宿主基因型检测，通常在进行用药指导或治疗时进行，检测一次即可。4.5.2 根据临床意义选择正确的标本类型 不同标本类型中的病原体可能是处在不同生命周期中的病原体，其分子检测的临床意义可能不同。例如外周血单个核细胞（PBMC）可用于检测HIV整合入宿主基因组的前病毒DNA（即潜伏病毒），而血浆用于检测HIV的病毒RNA（即游离病毒），在对HIV感染产妇所生的未满18个月的婴幼儿进行早期诊断时，应选择HIV DNA检测，以
39、免受到母亲以及婴幼儿预防性抗病毒治疗的干扰而影响诊断。4.5.3 根据标本类型正确判断检测结果 不同的标本类型可能导致检测结果有显著差异，这些差异将影响临床决策，因此要依据临床需要选择正确的标本类型，如EBV在全血中的病毒载量比血浆高1个log。5. 感染性疾病相关个体化医学分子检测的分析中质量控制5.1 实验室设计要求 参见医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法等相关要求，同时需根据病原微生物实验室生物安全管理条例和人间传染的病原微生物名录对所检测的病原微生物进行风险评估，然后在相应生物安全级别的实验室按照实验室生物安全通用要求和血源性病原体职业接触防护导则等卫生法律法规和各项生物安全管理规
40、范开展检测工作。例如结核分枝杆菌分子检测，如仅涉及少量活菌可在BSL-2级实验室开展，但如果需要先进行培养，则需要在BSL-3级实验室开展。5.2 常用的分子检测方法5.2.1 聚合酶链反应（PCR）5.2.1.1 基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至95左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，它与引物结合，为下轮反应作准备。模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至最佳退火温度，引物与模板DNA
41、单链以互补序列配对结合。引物的延伸：DNA模板引物结合物在72条件下、利用DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性退火延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。5.2.1.2 主要类型及临床应用5.2.1.2.1 定性检测 定性检测包括病原体分子分型、耐药基因突变及宿主基因型检测。 等位基因特异性PCR（allele specific-PCR, ASO-PCR
42、）：又称作ARMS（amplification refractory mutation system）或PASA（PCR amplification）。基本原理：根据基因变异位点设计特异引物，其中一条链（特异链）的3末端与突变位点的碱基互补，另一条链（通用链）按常规方法设计。因为特异引物在变异基因型中有扩增产物，在野生型中没有扩增产物，用凝胶电泳能够很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定有无突变基因型。常用的结果分析方法：a)琼脂糖凝胶电泳。b)聚丙烯酰胺凝胶电泳。主要特点：对实验条件要求较低，操作简单易行，成本低，重复性好，所需DNA的量较少且对DNA质量要求较低；但对引物设计要求较高，且仅
43、能进行已知突变检测。2 多重PCR（multiplex PCR）基本原理：多重PCR在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR。常用的结果分析方法：毛细管电泳法（capillary electrophoresis, CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）：是利用离子的电泳迁移率不同，在电场中移动的速度不同，从而将不同的离子分离。高效液相色谱层析（high performance liquid chromatography, HPLC）：溶于流动相的各组分在经过固定相时，与固定相发生
44、作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，导致在固定相中滞留的时间不同，由此判断待测物。单链构型多态性分析（single-strand conformational polymorphism, SSCP）：是利用不同空间构型的DNA分子，在凝胶电泳中的泳动速率不同，从而区分变异的DNA分子。主要特点：多重PCR经济简便，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大地节省时间，且节约开支；但特异性会有所降低，且仅能进行已知突变检测。3 长距离反向PCR（long distance inverse PCR, LD-IPCR）基本原理：根据已知的核心DNA去末端序列设计两条引物，使两引物
45、3端相互反向。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段，从而获得引物外侧的DNA片段。常用的结果分析方法：脉冲场凝胶电泳（PFGE）：利用定时改变电场方向的交变电源以分离大分子DNA。标记寡核苷酸探针：针对待测基因设计相应的特异性标记寡核苷酸探针，使其在固相或液相中与扩增产物反应，检测相应的荧光信号即可判断待测样本的基因型。主要特点：LD-IPCR适用于较长序列的分析，且不需预知待分析序列的具体结构；但方法较为复杂，需要特殊仪器。4 实时荧光定量PCR（qPCR或real-time PCR）基本原理：实时荧光定
46、量PCR是指在PCR反应中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。基于检测PCR扩增周期每个时间点上扩增产物的量，通过荧光强度变化监测产物量，从而实现对起始模板定性或定量检测。根据使用的荧光标记类型可分为探针类和非探针两大类。非探针类是利用非特异性的插入双链DNA的荧光结合染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。探针类则是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。前者简便易行，而后者由于增加了探针的互补识别步骤，特异性更高。常用的特异性荧光探针及其特点：TaqMan探针：是目前临床应用最广泛的探针之一。TaqMan是一类寡核苷酸探针，依据目
47、标DNA序列的上游引物和下游引物之间的序列配对来设计。探针的5-端用报告荧光染料（reporter fluorescence dye，R）标记，3-端则标记淬灭染料（quencher dye，Q）。当完整的探针与目标序列配对时，5-端报告荧光基团发射的荧光因与3-端的淬灭剂接近而被淬灭。但随着PCR延伸，DNA聚合酶的5-端外切酶活性将探针切开，使得荧光基团与淬灭剂分离，报告基团的荧光得以释放而被检测。TaqMan MGB探针：是在TaqMan探针基础上改进而来的，其3端不是淬灭基团而是一种非荧光淬灭剂，另外3端还增加了一个小沟结合分子MGB，该分子能够结合在双链DNA小沟部位，从而使探针与模板紧密结合。MGB的存在提高了探针的Tm值，一般12-17bp的探针在MGB的作用下Tm值可升高15-30，从而使它能够分辨单个碱基的差别；而且连在MGB分子后的是非荧光物质