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1、畜牧兽医学报2016，47(7)：12991305Ac口、音Pri咒o，i口gf Zoofec矗咒icn Sinicndoi：10。11843jissn03666964201607001CRISPRCas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用王玮玮，刘瑞琪，吴勇延，杨严格，王勇胜，卿素珠(西北农林科技大学动物医学院，杨凌712100)摘 要：CRISPRCas(C1ustered regularly jnterspaced short pa!indromic repeats(CRISPR)CRISPRassoc；ated(Cas)系统是由一种短小RNA调控的对DNA修饰的基因编辑
2、工具，是一种较锌指核酸酶(Zincfingers nuclease，ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcnption actjvatorlike(TAL)effector nucleases，TALEN)打靶更加快速、高效、精准的新型基因组编辑工具，它易于设计，且具有特异性。本文回顾了cRISPRcas系统的结构与功能，概述了Cas9的设计策略、影响C口s9基因编辑效率的因素、脱靶检测分析方法及其在动物基因编辑研究中的应用。基于CRISPRCas9已经在多种动物上成功实现了基因编辑，它有望成为建立动物模型和研究疾病防治的一种新型可行性途径。关键词：CRlSPRCas9系统；基因编
3、辑；sgRNA；基因敲除；基因敲入；动物模型中图分类号：S8133 文献标志码：A 文章编号：03666964(2016)071299一07The Progress of CRISPRCas9 System and Its AppIication in Animal Genetic EngineeringANG Weiwei，LIU Ruiqi，WU Yong-yan，YANG(CDz妇e o厂u拥竹口删地d渤P，N0r胁伽s跳&Yange，ANG Yongsheng，QING SuzhuF Uhi口Prsiy，Ya行gZi行g 712100，C矗j竹n)Abstract：CRISPRCas(
4、Clustered reguIarly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)CRISPRassociated(Cas)system is a DNA modified gene editing tools regulated by a kind ofshort RNAThis technology is a noveI tooI，which is more rapid，efficient and accurate than ZFN(zincfingers nuclease)and TALEN(transcription activatorl
5、ike(TAL)effector nucleases)in genetic engineeringIt is easy to be designed and has specificityThis paper reviews the structureand functi。n of CRISPRCas9 system and the design strategy oCas9 and its apphcation in animalgenetic engineeringCRISPRCas9 is successfully used in a variety of animaJ genetic
6、editing，it is1ikely to become a new way to establish animal models and to develop a new feasible approach toprevent diseas eKey words：CRISPRCas9 system；genetic engineering；sgRNA；gene knockout；gene knockin；anima】mode】s1 CRISPRCas的兴起1987年，日本科研人员1 3在大肠杆菌的基因组中发现了一系列相互间隔的短回文序列(Clusteredregularly interspa
7、ced short palindromic repeats，CRISPR)，这种短回文序列可以给细菌与古细菌提供获得性免疫，当时有研究者预测了CRISPRCas可能是一种新的DNA修复系统睁“。CRIsPR收稿日期：2016一0108基金项目：陕西省农业科技创新与攻关项目(2014K02一05一o】)；2015年西北农林科技大学第二批基本科研业务费科技创新专项(z109021566)作者简介：王玮玮(1990一)，女，甘肃兰州人，硕士生，主要从事动物组织胚胎学方面的研究，Email：welweiwan91 9901 63c。m*通信作者：卿素珠，主要从事动物组织胚胎学及生殖内分泌调控研究，Em
8、ail：suzhuqing163com万方数据1300 畜牧兽医学报 47卷Cas系统广泛存在于原核生物中，87的古细菌和48的细菌中都含有此种蛋白免疫系统5|。最初，CRISPRCas系统无法应用在人和动物上，经过改造，它作为一种以核酸酶为核心的基因编辑技术逐渐被广泛应用。2 C麟PlVCas9系统的基因结构和作用机制21 CRISPRCas9系统的基因结构目前有3种CRISPRCas系统(I、)，Cas9核酸蛋白酶主要构成和表达型CRISPRCas系统。每个系统包含一群与CRISPR相关的基因、非编码RNA和一个独特阵列的正向重复元件，其中最常见是的肺炎链球菌S户咒e“，加7zi口Ps9(
9、spCas9)系统，即型CRISPRCas9系统。CRIsPRCas9系统至少需要3个组件：一个CRISPR相关核酸酶、一个特异性CRISPR RNA(CRISPR RNAs，crRNA)和一个反式激活CRISPR RNA(TransactivatingcrRNA，tracrRNA)6。有研究人员为了精简这一技术，设计出了代替crRNAtracrRNA复合物的单链向导RNA(Singleguide RNA，gRNA)7，它可以将Cas9核酸酶引导到目标打靶位点对双链DNA进行切割。此外，tracrRNA上还有一个结构叫做tracrRNA尾巴(TracrRNA tail)，该结构有利于增强Cas
10、9核酸酶的表达8。CRISPR是一些相互间隔的短回文重复序列，序列长度为2148 bp，这些重复序列常常产生发卡结构，而且发卡结构的重复次数可达200次以上5。每个重复序列都被外源性DNA靶点中与之结构相似的短重复序列所隔开，叫做典型间隔区域(Protospacer)，这些间隔区域序列决定了CRISPR系统的种类以及靶基因的识别位点9。在DNA靶点之内，每个典型间隔区域始终与典型间隔相邻基序(Protospacer adjacent motif，PAM)相邻，PAM可以根据特异性CRISPR系统而变化1川。常用的PAM有3种类型，分别为NGG、NAG和NNGG】。cas9蛋白含有两个核酸酶结构
11、域，一个是HNH结构域，另一个是RuvC样结构域。HNH核酸酶结构域和RuvC样核酸酶结构域分别切割目标DNA链的一条单链口2|。这样的单链切割容易产生突变，可能是由于HNH和RuvC的存在1引。22 CRISPRCas9系统的作用机制如图1所示，PAM序列引起Cas9蛋白识别，使得与tracrRNA相连的单链向导RNA(Single guideRNA，sgRNA)与目标位点(Target sequence)识别，保证了Cas9蛋白和基因组稳定地结合，引起目标位点的切割，从而产生DNA双链断裂(Doublestrandbreaks，DSB)1引。DNA双链断裂后引起非同源末端连接(Nonhom
12、01090us end joining，NHEJ)或者同源性定向修复(Homology_directed repair，HDR)，各个单链通过高精确度的碱基切除修复机制(Baseexcision repair，BER)进行修复6|。CRISPRCas9系统可以同时对靶基因进行高效的基因敲除(Knockout)和基因敲入(Knockin)编辑，如图2所示，只需对目的片段进行切割，通过NHEJ机制修复而引入插入或缺失的突变，就可以达到Knockout的效果。Knockin则是将外源有功能的基因转入基因的同源序列中，通过HDR修复，进行Knockin或者点突变，使插入基因组得以在细胞内表达17，高效
13、地对特定位点同时进行Knockout和Knockin是Cas9系统的一种特色，只需要改变供体载体(Donor vector)上的外源基因即可。图l CRISPRC嬲9系统的作用机制Fig1 Mechanism of CRISPRCas9 system23 Cas9与传统技术的对比早期的基因编辑技术主要有锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)。ZFNs是由锌指序列组成，FokI核酸酶结构域通过二聚体作用产生核酸内切酶活性从而切开DNA双链。转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)与ZFNs的构建原理相似，设计更加优化，靶向特异性更加明确。CRISPRCas9系统作为
14、第3代的人工核酸酶技术，与ZFNs和TALENs相比，其优势在于打靶位点多，平均8个碱基就有一个打靶位点，ZFNs几乎到500个碱基才有一个合适万方数据7期 王玮玮等：CRISPRCas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用 1301的打靶位点18。其次是Cas9载体构建简单，只需根据特异性打靶位点设计sgRNA，而ZFNs和TALENs则需要对每个打靶位点设计和组装一对核酸酶。再者就是Cas9可以高效地进行多位点编辑，而ZFNs和TALENs的一对核酸酶一次只能切割一个位点，很难提高突变率。但是Cas9的脱靶率要高于ZFNs和TALENs1 9。叩l cleava咎by nuc
15、leaSes08BHDR NHEJ GccA丁f，AcGcTAA(，n1固：cI，TI，l，ATAGA邶，l，mTccccTAI AITGf：从rnAI；A圃cc【tTATc丌川，M11c(：c【，j兀，cccTI，rcG田LI小”，GATI，TI，I，11TI二ccGT(ActGc(，几(讯圆(，r，觚fftC订(：AGTct；(，AmCAC(咒TAl，rCCGTI，I，rACAArI，I，兀nJGC(，rAt，ACT(；(，AT兀：t|：(。ITrf二丌A(：I(，TI：；(：f：n承：AC，(：YHAC rm，(，厂f，下(，f，H，1￥jf1HilCCTt，“，M可：CAl：I二TrI
16、：W(一l，ll：cI：=二ArGTcAc6(T从6他Tm汀=刁下r习ccI，rcI，ATAGATtmTcTc ccI：mTcAcTAcTc【0(I，rATAcATI，cTcTc ，ArcTI：I，AI I二l二T ccT AI，T(七rI，丁IcfFrA(：A哪沁；A1Ac高霄=硇l，11：TATcnccAcTccccTcAcTGcf丌【：Ac回cI、I：l：cTATc丌Aft：AcTc I，TcAcTl，t，t，A cc丁A丁I：1TAl、，Gene or tag insertion Gene corrccfion or pojnt mu恤genesis Small讷defs图2 caS9
17、核酸酶的切割和修复机制”Fj备2 CleaVage by nucleases and repa主r mechanism of Cas9 nuckases3 Cas9的设计策略3，1 单链向导RNA的设计sgRNA从5开始到3依次为DNA互补区、crRNA和tracrRNA，其中DNA互补区的设计对打靶效率有至关重要的影响2。sgRNA中有一个12个碱基组成的毗邻PAM上游的独特序列，被称作“种子区”21。，“种子区”发生错配对靶位点的识别影响更大2 2|。sgRNA和目的片段之间一定数量的错配是可以被容忍的，特别是当这些错配离PAM较远的情况下2 3|，因此在设计sgRNA时需要注意发生错配的
18、序列位置。针对基因组设计sgRNA的一般标准是：紧邻着PAM序列(5_NGG一3 7)的12个碱基的种子区的3端最多允许出现1个错配；在单链向导RNA(sgRNA)5 7末端8个碱基的区域允许出现5个错配L2。总的来说就是要严格遵守碱基互补原则来设计靠近PAM的12个碱基序列，尽量保证该序列内没有突变或者错配。但是相对于前人的研究，第7到第12个碱基也没有一些特别的序列口4矧。也有研究表明，增加茎环结构和3 7尾部结构可以加强向导RNA的稳定性，有利于Cas9形成正确构象6。32 关于DNA打靶序列目前仍然不能确定设计打靶序列的精确标准心“，只是根据一些常规标准，在众多打靶位点中选择出较好的打
19、靶位点。目前设计打靶序列的在线软件：http：zifit partnersorgZiFiTChoiceMenuaspx、http：wwwecrisporgECRISPdesigncrisprhtml、http：wwwrgenomenet，http：crisprmitedu、https：chopchoprcfasharvardedu。这几款在线软件中，前两个的主要功能是寻找打靶序列，之后需要进行人工筛选，结果较为可靠。http：www。rgenome。net这个软件可用来寻找打靶序列并且设计向导RNA，而且还可以设定所需的碱基错配数。http：crisprmitedu和https：chopcho
20、prcfasharvardedu可以对生成的sgRNA进行排名以供选择，唯一不足是其数据库内的物种有限8I。33影响cas9打靶效率的因素设计向导RNA时，GC含量一般为4560为宜，超过这个范围都会影响Cas9的靶向效率以及c碱基富集瞳。C碱基富集使得容易打靶在DNA甲基化的位置，尽量避开甲基化位点有利于减万方数据1302 畜牧兽医学报 47卷少表观遗传突变。但是与之矛盾的是有研究指出甲基化只影响ZFNs和TLAENs，并不影响Cas9的切割效率口。DNA聚合酶I超敏感位点(DHS)属于染色质结构的一种状态，可以显著提高转录因子结合位点的细胞特异性预测，将靶向序列设计在DHS内可提高基因编辑
21、效率口0|。此外，选择靶向位点时，尽量选择外显子区域而非内含子区域，这是因为内含子对翻译产物的意义不大且比外显子更易产生突变。4切割效率和脱靶效应的分析及检测人工设计的核酸酶经常会产生脱靶切割，在基因序列中引起突变(插入、缺失、倒置或易位)，从而使基因异常表达、细胞死亡或发生肿瘤。20 nt的sgRNA与目的片段之间一定数目的错配数导致大量的脱靶突变产生31|，因此很难彻底和有效地确认潜在的脱靶位点。体外试验表明，不同类型的PAM可能会影响CRlSPRCas9的切割活性，按照PAM的要求，在基因组上可以产生很大的打靶范围，打靶位点过多会导致基因片段在多个位点被切断，这也是Cas9容易脱靶的主要
22、原因。41检测切割效率和脱靶效应的主要手段检测切割效率和脱靶效应的主要手段：1SURVEYOR法或T7ENl酶切法。两种方法都属于利用核酸内切酶检测脱靶情况。SURVEYOR酶是CELI错配特异性核酸酶的一种，能准确切割异源双链DNA错配位点。T7ENl酶能识别并切割不配对的双链DNA，将基因编辑后序列与基因编辑前序列相比较，看一定范围内碱基序列是否发生变化。2SSA报告载体检测法。该方法是建立SSA报告载体，报告载体上Luciferase蛋白失去活性后，在目标位点发生打靶后通过比对Luciferase的活性，评价核酸内切酶的切割效率和脱靶情况3 2|。该法是较为精密的测试脱靶效应的方法。3S
23、anger测序法。直接性地对PCR产物进行测序或者间接性地转入TA克隆载体中，挑选单克隆进行测序。4DigenomeSeq技术。提取基因组后进行高通量测序，它属于全基因测序的一种方法，可以全面有效地检测脱靶效应3引。42降低脱靶效率的方法目前，可通过3个方面来降低C口s9基因编辑中的脱靶效应8：第一，提高sgRNA的特异性：(1)尽量降低预测的脱靶位点与sgRNA之间的配对碱基数；(2)设计的sgRNA与预测的脱靶位点在“种子区”至少有2个碱基的错配；(3)尽量避免出现sgRNA与预测的脱靶位点序列有连续的或间隔的4个碱基配对。SWCho等口41的研究证明修饰sgRNA可以降低Cas9的脱靶效
24、应。(4)缩短sgRNA的长度。将20 nt的sgRNA改造成1718nt的缩短型sgRNA，有效地降低了脱靶率口引。第二，改造Cas9蛋白。FARan等致力于改造更高特异性的Cas9蛋白，将Cas9蛋白改造为双切口酶(Doublenicking)，将Cas9切口酶突变体与成对的sgRNA相结合产生一种新的复合蛋白以完成特异性双链断裂31|。第三，还可以将Cas9一D10A切口酶与一对sgRNA配合使用产生SSB(Sin91estrandbreaks，SSB)，以减少因细胞核内不存在DNA同源修复模板而引起的脱靶突变3 6|。5 Cas9在动物基因编辑研究上的应用51 基因敲除2013年，美国
25、科研工作者基于CRISPRCas9技术在细胞系上进行基因敲除，利用靶位点特异性RNA，将Cas9核酸酶引导到基因组的目的位点上进行切割并引起突变。以小鼠为动物模型的Cns9基因打靶技术已经革新为“一步法”，该法可实现多重基因组编辑引。HWang等383选择对乳家族基因(TeneIeven translocation family members)进行敲除，Te基因的突变可以引起多种肿瘤尤其是造血系统肿瘤。研究人员用显微共注射方法，将C口s9 mRNA和sgRNA共同注射到小鼠受精卵中同时敲除TP1和T以2，经验证敲除效率在80左右，该试验成功地产生双等位基因突变的小鼠，并且是首次在动物体内同时
26、敲除2个内源性基因。YNiu等选择P声口产)，(Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma)和R口91(Recombination activating gene 1)两个靶基因，将C口s9 mRNA和单链向导RNA共同注入食蟹猴受精卵中，在一个步骤中同时打靶这2个基因，在全基因分析检测中没有发现脱靶现象，最后成功获得了经过基因修饰的转基因食蟹猴3 9|。灵长类动物在遗传特性和生理功能方面与人类接近，可以作为研究模型来进行人类某些疾病致病机制及治疗策略的研发。FChen等4叩利用CRlSPRCas9系统敲除猪免疫球蛋白M(IgM)重链基因的J
27、H区域(Joiningchain)，此区域对免疫系统的发育和分化有至关重万方数据7期 王玮玮等：CRIsPRCas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用 1303要的作用。在体细胞核移植技术的支持下，将IgM抗体的Cas9质粒转染仔猪胎儿成纤维细胞后，基因敲除的效率高达533，其中25阳性克隆有双等位基因修饰，这比传统的同源重组效率高很多41|。XZhou等人采用Cas9sgRNAs的方式，敲除了猪胎儿成纤维细胞上PARK2基因(Parkin2)和PJNK 1基因(PTENinduced putative kinase 1)，以突变型细胞克隆为体细胞移植的供体，产生纯合子的转基因
28、猪2I。MS丁N基因(Myostatin)编码的氯化筒箭毒碱会抑制肌肉的分化和生长，研究人员利用CRISPRCas9技术将特异性MSTN基因的CRISPRCas9 mRNA显微共注射到绵羊受精卵的胞质中，结果显示胚胎发育突变率达504 3I。在山羊上，在成纤维细胞敲除MSTN和FGF5基因的效率都是60，而在98只试验动物中分别敲除了MS丁N和FGF5基因后存活下来的动物只有15和21，双基因修饰后存活下来的动物为104“，这些研究提示CRISPRCas9系统可作为动物优质性状新品种培育和抗病育种有效的基因编辑工具。通过注射JL2RG和R乜91基因的Cns9 mRNA和sgRNA到原核期胚胎的
29、细胞质中，可获得高达100效率的双等位基因敲除兔，同时敲除3个基因(，L2RG，RAGl和RAG2)和5个基因(JL2RG，RAGl，RAG2，TJKn和ALB)的效率均可达到3334 5。NVron等运用活体点穿孔技术，有效敲除鸡胚胎干细胞中的转录因子PAX7(Paired box7)，使野生型多细胞动物产生镶嵌式基因突变6|，使鸡胚胎干性基因的相关功能丢失。Cas9技术在斑马鱼上也实现了高效率的多基因修饰，crRNAtracrRNACas9蛋白质复合物使内源基因表达可视化，这是在冷水动物模型上的首次突破n 7。52 基因敲入有研究发现如果提供同源DNA，可将外源性序列定点敲人到斑马鱼胚胎的
30、特定靶点，插入效率为3。51564引。潜在脱靶位点的突变率只有1125，体现了Cas9系统的特异性。截至目前，利用Cas9系统编辑牛基因组的相关文章屈指可数，可能是因为牛较长的妊娠周期和Cas9易于脱靶的性质4 9I。2016年，研究者利用NHEJ途径有效地将一个46 kb的无启动子载体整合到GADPH基因位点上，在人体细胞和胚胎干细胞上的敲入率分别为20和17，并且证明NHEJ途径比HDR途径的敲入效率要高，但并没有评估NHEJ途径可能引起的细胞毒性问题。6 结 语Cas9系统是微生物自我保护的一种独特机制，这种保护机制是为了防止外来微生物的侵入5川。它是继ZFN和TAI。EN之后出现的更为
31、快捷和有效的基因编辑工具，该技术旨在提高对特异性序列的识别与结合的能力以及酶切效率，越来越多的研究利用Cas9系统提高了基因编辑在不同物种上的可能性。由于Cas9核酸酶的PAM(5，-NGG一3 7)很短，几乎在任何物种上都可以找到，这就解决了基因编辑工具在跨物种方面的难题，其他基因编辑工具并不能直接做到。高效、时间成本低、一个基因组上可进行多个基因位点编辑以及基本不受物种限制都是Cas9基因编辑技术异军突起的优势。当然，CRISPRCas9基因编辑技术也存在着一些不足，如容易脱靶且潜在脱靶位点多、基因突变以及影响打靶效率的因素过多等。脱靶和影响打靶效率的因素尚可预测，但基因突变是难以预测的。
32、基因编辑过程中产生的基因突变是CRISPRCas9打靶系统的副作用，Cas9核酸酶可能会结合到意想不到的位点，导致某些位点发生基因突变。这些都是Cas9系统需要改进的方面。研究者们也在致力于不断探索和优化CRISPR系统的研究，以使其更加快捷、简便、完善。IMSlaymaker等在金色葡萄球菌中找到了比Cas9核酸酶更小的一种蛋白，它的强大在于更易进入成熟细胞以及更容易切割产生黏性末端以增加DNA序列与载体间的连接5 2|，随后该团队又在2016年改造出新型 eSpCas9(“Enhanced specificity”，SpCas9)基因编辑系统，eSpCas9既降低了脱靶效率又延续了高效、高
33、准确度打靶效率口3|。相信随着CRISPRCas9基因编辑技术的不断优化和完善，其在动物基因编辑研究中的应用将更为广泛，在动物新品种培育、抗病育种及生物医学领域的疾病研发方面发挥重要作用。参考文献(References)：r 1 ISHIN0 Y，SHINAGAWA H，MAKIN0 K，et a1Nucleotide sequence of the iap gene，responsible foralkaline phosphatase isozyme conversion in E5cPrifi口cozi，and identification of the gene productJ-，B
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