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1、第3 7卷第1期2 O 1 6年1月西安交通大学学报(医学版)Journal of Xian Jiaotong University(Medical Sciences)V0137 NO1Jan2016基础研究热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定王孝珑1，周培华1，郑见宝1，魏光兵1，陈南征1，姚建锋2，孙小菊3，孙学军1(1西安交通大学第一附属医院普通外科，陕西西安 710061；2陕西省人民医院普外一科，陕西西安710068；3西安交通大学第二附属医院手术室，陕西西安 710004)摘要：目的 检测已构建热反应元件修饰的端粒酶逆转录酶hTERT基因启动子(8HSEshTERTp)调控的基
2、因表达载体肿瘤特异性和热诱导特性。方法 RT PCR、Western blot和免疫细胞化学检测细胞内hTERT mRNA和蛋白表达水平，选择hTERT高表达和低表达的细胞株作为该研究阳性细胞株和阴性细胞株；收集前期已包装成功的热反应元件8HSEs和人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp联合调控自杀基因PNP表达的慢病毒表达载体8HhP病毒液，感染hTERT+sw480细胞及hTERTMKN28细胞、hTERTMRc一5细胞，细胞免疫荧光技术检测该治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性；并用western blot和RTPCR分别检测热刺激条件下目的基因PNP在不同hTERT水平细胞株中的表达水平。结果
3、 hTERT mRNA及蛋自在Sw480细胞中高表达，在MKN28细胞和MRC一5细胞中低表达甚至阴性表达；免疫荧光、RTPCR和western blot结果显示，8HSEshTERTp调控的目的基因PNP只有在43处理下的Sw480细胞中呈现高表达，而在阴性细胞株MKN28和MRD5中PNP表达较少，而常温下SW480细胞中PNP的表达水平明显低于热处理组。结论8HsEs修饰的hTERT启动子可以明显提高治疗载体的肿瘤特异性及热反应特性。关键词：热反应；hTERT启动子；自杀基因PNP；治疗载体；western blot；RPCR；细胞免疫荧光中图分类号：Q78 文献标志码：ADOI：lO7
4、652jdyXb201601002Targeting Validation of a heat-induced，tumorspecific gene therapy VectorWANG Xiao一】on91，ZHOU Peihual，ZHENG Jian-ba01，WEI Guang-bin91，CHEN Nanzhen91，YAO Jianfen92，SUN Xiaoju3，SUN Xuejunl(1Department of General Surgery，the First Aff订iated Hospital of Xian Jiaotong UniVersity，Xian 7100
5、61；2Department()ne of General Surgery，Shaanxi ProvincialPeoples Hospital，Xian 710068；3Department of Operation Room，the SecondAffiliated Hospital of Xian Jiaotong University，Xian 710004，China)ABSTRACT：ObjectiVe To vcrify tumo卜and heat-specificity to hyperthermia stimulation of a gene therapyvector co
6、ntaining the gene PNP regulated by the eight heat shock elements(8 HSEs)and the hTERT promoterMethods The expression of hTERT was measured by RTPCR，Western blot and immunocytochemistry assaysThe recombinant lentiviral vector pLVX一8HSEs-hTERTpPNP-3FLAG(8HhP)containing an hTERT promoterand 8 copies of
7、 the HSEs，which was constructed in our previous study，was collected8HhP was transfected intohTERT+SW480 cells，hTERT MKN28 cells and hTERT MRC-5 cells；then the tumo卜and heatspecificity wasverified bv immunofluorescence， Western blot and RTPCR were used to examine the expression of PNP underheated con
8、ditionsResuIts hTERT mRNA and protein expressions were high in SW480 cells，but low or negatiVein MKN28 and MRC一5 celIs The expressions of PNP protein and mRNA in 8HhPSW480 cells were obViouslyincreased onlv under heated conditions，which was confirmed by Western blot，RTPCR and immunofluorescenceIn co
9、ntrast，the expressions of PNP protein and mRNA in 8HhPMKN28 and 8HhPMRC-S cells were low ornegative even under heated conditionsCOncIusiOn The hTERT promoter modified by 8HSEs can increase thegene therapy Vector speclflclty to hyperthermla and tumorsKEY WoRDS：hyperthermia；hTERT promoter；suicide gene
10、 PNP；therapy Vector；Western blot；RTPCR；jmmIlnofluorescence收稿日期：201 5 0422 修回日期：20l 5一09 1 7基金项目：国家自然科学基金资助项H(No811 72362，N。81172359)；陕西省科技统筹创新工程计划项目(No2013KTCQ03一08)Supported bv the NationaI NaturaI Science Foundation of China(No811 72362，No81172359)and the Coordinated and InnovativePlan Projects of
11、 Scjence and Technology in Shaanxi Province(No2013KTCQ03一08)通讯作者：孙学军E mail：sunxymailXjtueducn优先出版：http：wwwcnkinetkcmsdetail611399R201 51 2091 601008html(2015一12一09)http：wwwjdyxbcn；http：yxxbxjtueducn万方数据10 西安交通大学学报(医学版) 第37卷现阶段基因治疗因为产生严重的副作用及较弱的靶向性而遇到了巨大挑战1。肿瘤组织靶向性是肿瘤基因治疗成功的关键，因为治疗基因的过表达可以对肿瘤组织周围的正常组
12、织细胞产生毒性作用。所以，寻找靶向性更强启动效率更高的治疗载体是肿瘤基因治疗的重大挑战之一，含有肿瘤组织特异启动子和可诱导转录元件的治疗载体可能成为一种肿瘤基因治疗有效的手段2。人端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)启动子是一种具有较好肿瘤组织特异性的启动子，但是其启动效率较低口。为了进一步提高该启动子在肿瘤组织中的表达特异性并增强其转录活性，并联合肿瘤热疗的综合治疗手段，根据热反应元件(heat shock element，HSE)是肿瘤热疗中的关键调控元件，本课题组前期构建完成8个拷贝的HSE(8HSEs由8个重复的理想化
13、的HSE片段AGAACGTTCTAGAAC构成，中间用36个任意碱基分开4。5)和hTERTp6，组成双靶向联合调控元件，调控大肠杆菌PNP基因表达的慢病毒表达载体pLVX一8HSEshTERTpPNP一3FLAG(8HhP)，并完成病毒包装及滴度测定。利用8HhP病毒感染hTERT十SW480细胞及hTERlL MKN28MRC一5细胞，并在热刺激条件下检测稳定转染细胞株中目的基因PNP的表达，研究热处理对治疗载体8HhP表达的调控作用，为利用热疗联合肿瘤慢病毒基因治疗提供实验依据，同时为下一步的细胞实验奠定了基础。1材料与方法11 细胞系及主要试剂 hTERT+人结肠癌细胞株sw480为实
14、验组细胞，hTERT人胃癌细胞株MKN28和hTERT一人胚肺上皮成纤维细胞株MRC_5为对照组细胞，慢病毒表达载体8HhP及对照慢病毒表达载体pLVX-Ubi一3FLAG(CON)病毒液均由本课题组前期保存。胎牛血清和RPMI 1640、MEM培养基购自Gibco公司。逆转录试剂盒及PCR所用试剂和酶均购自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。细胞RIPA蛋白裂解液及BCA蛋白定量试剂盒均购自赛默飞世尔生物科技(中国)有限公司。3FLAG单克隆抗体购自Sigma公司，hTERT单克隆抗体购自上海生工生物工程有限公司，RNA提取试剂盒Fast200购自先锋生化科技有限公司。12
15、 方法121 RTPCR、Western blot和免疫细胞化学法筛选hTERT高表达及低表达细胞株 在6 cm培养皿中培养本课题组保存细胞株，至7080融合时，弃培养液，冷PBS冲洗，按RNA提取试剂盒Fast200说明书提取总RNA。取10 pL总RNA、10肛L primescript RT Master Mix和30肛L无RNA酶水，在50扯L体系中进行cDNA合成反应。hTERT上游引物：5一ATCAGACAGCACTTGAAGAG一3，下游引物：5，_GTAGTCCATGTTCACAATCG一3，扩增片段150 bp。内参照|3一actin上游引物：5，-CTTAGCACCCCTG
16、GCCAAG一3，下游引物：5，_GATGTTCTGGAGAGCCCCG一3，扩增片段151 bp。PCR条件均为：94变性3 min，然后进行30个循环的扩增：9430 s；5530 s；721 min。hTERT PCR循环数为22，Bactin PCR循环数为25。以口一actin为内参照分析hTERT mRNA相对灰度水平。在10 cm培养皿中培养本课题组保存细胞株，至7080融合时，弃培养液，RIPA裂解法提取上述细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，与5SDS凝胶加样缓冲液混合，985 min使蛋白变性，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转于PVDF膜100 V 120 min，以
17、含脱脂奶粉的TBST 37封闭1 h，加hTERT一抗(1：1 000)，pactin一抗(1：1 000)，4过夜；二抗(1：5 000)室温1 h，ECL显影，凝胶成像系统扫描并计算相对灰度。将清洁、灭菌处理的盖玻片铺于24孔板底部，将处于对数期生长课题组保存的上述细胞(3104mL)接种于板内，48 h待细胞长成单层后，取出盖玻片，用10 mmolL PBS冲洗两遍，再以多聚甲醛固定30 min，TritonX一100固定10 min，使用hTERT兔抗人一抗(1：100，Sangon biotech)4孵育过夜(空白对照采用PBS代替一抗)，加入1：300生物素化羊抗兔二抗室温孵育1
18、h，然后滴加SABC试剂37孵育30 min，最后用DAB显色，苏木素复染，光镜下观察拍照，ipp6软件计算图片相对灰度。122细胞免疫荧光法检测目的蛋白PNP的表达将清洁、灭菌处理的盖玻片铺于24孔板底部，稳定转染细胞株(3104mL)接种于板中，待细胞贴壁后经过37或43处理1 h，24 h后，多聚甲醛固定，小牛血清封闭，兔3FLAG单克隆抗体室温孵育(1：150，sigma)1 h，羊抗兔FITC抗体1：100稀释室温孵育1 h(eBioscience，San Diego，CA，USA)，然后将细胞用10 mmolL PBS清洗，加入DAPI(1：10 000)孵育5 min冲去，阴性对
19、照采用PBS代替一抗，载玻片以甘油封片照相。123 Western blot检测热刺激调控下细胞内PNP蛋白的表达水平 复苏实验所需细胞株，传代后分常温组和高温组，分别在37和43培养1 h，常温组http：wwwjdyxbcn；http：yxxbxjtueducn万方数据l期 王孝珑，周培华，郑见宝，等热诱导肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定 1l及未感染细胞在普通培养环境中培养。24 h后，RIPA裂解法提取上述细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度，与5SDS凝胶加样缓冲液混合，985 min使蛋白变性，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转于P)F膜100 V 120 min，以含脱脂奶粉的
20、TBST 37封闭1 h，加3FIAG一抗(1：1 000)，pactin一抗(1：1 000)，4过夜；二抗(1：5 000)室温l h，ECL显影，凝胶成像系统扫描并计算相对灰度。124 RTPCR检测热刺激调控下细胞内PNPmRNA的表达水平 复苏实验所需细胞株，传代分为常温组和高温组，分别在37和43处理l h，常温组及未感染细胞在普通培养环境中培养：8 h后，用先锋Fast200RNA提取试剂盒按说明书要求提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。以Bactin为内参照，根据GenBank中大肠杆菌PNP基因片段序列(NP一4176334)设计如下引物并由上海生工生物科技有限公司合成，用
21、PCR方法扩增PNP。其上游引物：5_ATGGCTACCCCACACATT一3 7，下游引物：5-TTACTCTTTATCGCCCAGC一3，扩增片段720 bp，内参照8一actin上游引物：5一CTTAGCACCCCTGGCCAAG一3，下游引物：5，-GATGTTCTGGAGAGCCCCG一3，扩增片段151 bp。反应条件均为25弘I。的反应体系，94预变性3 min，94变性30 s，51退火30 s，72延伸1 min，PNP 30个循环，8一actin22个循环，最后72延伸7 min，最后至4终止。A SW480 MKN28 MRC一5 SW480， 气苫琼脂糖凝胶电泳观察结果
22、，以8一actin为内参照分析hTERT mRNA相对灰度水平。13统计学分析SPSSl9o软件分析数据，数据首先进行了正态性分布和方差齐性检查，组间比较采用两独立样本均数检验，各组数据以(zs)表示，PPpn寸o寸k芋Ap东-o寸万方数据38 西安交通大学学报(医学版) 第37卷参考文献：1AKIRA EA historical perspective on the discovery of statinsJProc Jpn Acad ser B Phys Biol sci，2010，86(5)：484r2HINDLER K，CLELAND CS，RIVERA E，et a1The role
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