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1、第7卷，第1 1期 光谱学与光谱分析Vol. 7， No. 11， pp0- 082 0 1 7年1 1月 Spectroscopy and Spectral Analysis November， 2017 FTIR及CLSM对转基因杨木细胞壁木质素含量及微区分布研究刘苍伟1 ，苏明垒1， 2 ，周贤武1 ，赵荣军1 ，吕建雄1 ，王玉荣1， 21.中国林业科学研究院木材工业研究所，北京 100091 2.中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京 100091摘 要 通过木质素基因工程能够有效降低杨木细胞壁木质素含量，从而改善人工林杨树作为木质纤维材料的利用现状。选取CH基因活性抑制表达的转基
2、因杨树和其对照组杨树为实验材料，利用傅里叶红外光谱( FTIR)技术快速表征CH基因表达活性降低后幼龄杨木细胞壁木质素的含量，并结合激光共聚焦显微镜( CLSM )和组织化学染色技术原位表征木质素含量微区分布变化规律。结果表明转基因杨树与对照组杨树红外谱图的形状和特征峰数目、位置基本一致，表明CH基因活性降低并未改变杨木细胞壁主要化学成分及结构，但I 1 508 I 1 79 ， I 1 508 I 1 25和I 1 508 I 1 70木质素特征峰高度比值结果表明转基因杨木木质素含量下降了8. 2% 9. 5% ，峰强度的区别说明CH基因活性抑制表达能够改变杨木细胞壁上木质素等化学组分含量;
3、 CLSM观察发现转基因杨木木质素微区分布含量均为纤维细胞角隅复合胞间层次生壁，与对照组木质素呈现相同的沉积规律，且转基因杨木细胞壁木质素浓度低于对照组杨木;组织化学染色的结果同样表明杨木S单体木质素均匀分布于纤维细胞壁上，而G单体木质素微区沉积规律为纤维细胞角隅复合胞间层次生壁，进一步揭示了CH基因活性的降低并没有改变转基因杨木G和S木质素单体的沉积规律，但对其纤维和导管壁上木质素单体含量分布有一定影响。关键词 转基因杨木;木质素;傅里叶红外光谱;激光共聚焦中图分类号: S781. 2 文献标识码: A DOI: 10. 96/ j. issn. 1000- 059( 2017) 11- 0
4、- 05收稿日期: 2017- 01- 18,修订日期: 2017- 05- 20基金项目:国家自然科学基金项目( 170562)和中央级公益性科研院所重点实验室专项课题( CAFYBB20120)资助作者简介:刘苍伟， 1991年生，中国林业科学研究院硕士研究生 e- mail: mugongsuolcw 16. com通讯联系人 e- mail: yurwang caf. ac. cn引 言杨树是我国重要的人工林树种，无论种植面积还是蓄积量均居世界首位，是我国制浆造纸和生物能源物质的主要用材树种，同时因其基因组小、易导入外源基因也是公认的林木遗传育种研究的模式树种 1- 2 。木质素是木材
5、细胞壁中重要的三大化学组分之一，属于芳香族高分子聚合物，具有增强细胞壁强度、抵抗病菌侵害以及保证水分和水溶性物质在木材中的运输作用 。另一方面，细胞壁木质素也是杨木在造纸、生物质能源等方面应用的主要屏障，目前去除木质素主要应用的化学剥离法需要大量化学药品，在增加经济成本的同时还污染环境 。因此通过基因工程抑制林木细胞壁中木质素合成基因的表达活性使木质素含量从根本上降低得到国内外学者的广泛关注 5 。CH ( coumarate - hydroxylase，香豆酸 羟化酶)基因属于细胞P50色素酶，位于木质素苯丙烷合成途径上，是控制木质素单体流向的重要调控基因，通过抑制其表达活性能够有效降低杨木
6、中木质素含量，并对其结构也有一定影响 6- 7 。对转基因植物的研究多基于幼苗，生物量少，因此学者在测定木质素含量时多采用样品用量少的微量Klason法、乙酰溴和GC M S等技术，操作相对复杂。 FTIR具有制样简单、用量少、操作方便且精确性高等优点，已广泛应用于木材细胞壁化学成分的结构分析，并通过不同特征峰吸收强度的比值预测样品化学成分含量的变化 8- 12 。 CLSM则可以利用木质素的荧光作用，根据荧光亮度的强弱直观观察木质素含量及微区分布的变化 1 。目前未见关于转CH基因幼龄杨树细胞壁木质素含量变化快速测定以及木质素的原位微区分布观测未见相关报导。利用FTIR快速判定及测定幼龄转基
7、因杨树细胞壁主要化学组成成分种类以及木质素含量的变化，并结合CLSM以及组织化学染色法探究木质素合成调控基因CH表达活性受抑制对转基因杨木细胞壁木质素微区分布的影响。以期通过揭示CH基因对转基因杨木细胞壁木质素含量以及木质万方数据素微区沉积的调控机理，为林木基因工程调控转基因杨木材质特性提供理论依据。1 实验部分1. 1 材料选取由中国林业科学研究院林业所及林木遗传育种国家重点实验室培育的转CH基因(平均活性下调75% )杨树及对照组杨树(指未调控CH基因活性，且与转CH基因杨树生长在同一环境中)为实验材料，幼苗在温室中培育，生长期为1 2年。截取后的杨树幼苗木段后分别放入FAA固定液中和气干
8、保存，用于组化染色、激光共聚焦显微镜观察和FTIR实验。1. 2 方法1. 2. 1 FTIR测定分析选取气干后的转基因杨树及对照组杨树小木段，剥离树皮和髓心后磨成0 60目木粉，并将溴化钾和木粉放入10烘箱中烘干备用。傅里叶变换光谱仪器为德国BRUKER公司的TESNSOR 27。将木粉与溴化钾按一定比率混合均匀后放入玛瑙研钵中进一步研磨，待测样品保存于红外仪器专用烘箱中以保证排除水分的影响。采谱范围: 000 00cm- 1 ，分辨率为16 cm- 1 ，扫描2次。所得红外谱图用Om-nic和Origin软件分析处理。1. 2. 2 激光共聚焦显微镜观察选取FAA固定液中的转基因杨树及对照
9、组杨树的幼苗木段。通过固定液清洗，梯度酒精脱水后，用Epon812中性树脂包埋，置于烘箱中固化。用半薄切片机制取1. 5 m厚切片，经0. 001%吖啶橙溶液染色及70%甘油封片后置于激光共聚焦显微镜下观察，仪器型号为ZEISS LSM 510M ETA，采用激发波长为88 nm，并在0倍物镜下观察拍照。1. 2. 组织化学染色选取FAA固定液中的转基因杨树及对照组杨树幼苗木段，利用滑走切片机制取20 m厚切片，用于M ule染色( 2%高猛酸钾溶液中染色 5 min，蒸馏水洗净， 10%盐酸溶液浸泡1 min， 29%浓氨水封片)和W iesner染色( 2%间苯三酚溶液染色 min，滴加6
10、 mol L- 1盐酸封片) ，并置于光学显微镜( ZEISS Imager A1)下观察拍照。2 结果与讨论2. 1 转基因杨木与对照杨木细胞壁木质素含量图1是转基因杨木与对照组杨木红外谱图，谱图经平滑、基线校正和归一化处理后用于分析。对比图1和表1中杨木样品的红外谱图峰位及波数，可知转基因杨木和对照组杨木的红外光谱特征吸收峰的位置、数目及形状基本一致，即无新峰出现也无旧峰消失，且与多年生杨木谱图特征峰相一致 10， 1 ，表明木质素CH调控基因活性的降低并未使杨木产生新的化学组成成分，谱图的差异主要是峰强度上，表征着化学成分含量的变化。在高波数区主要存在 21和2 921 cm- 1两个吸
11、收峰，而在1 800 800 cm- 1低波数区则存在较多吸收峰，也是表征、分析木材化学成分主要的红外特征峰区间，其中1 76 cm- 1共轭C O伸缩振动峰是表征半纤维素的特征峰， 1 509 cm- 1附近是苯环碳骨架振动常用来表示木质素含量的变化， 1 79和897 cm- 1等吸收带也是表征多糖物质的含量变化。两类杨木的红外谱图在某些峰位也存在一定差异， CH转基因杨木的2 902 2 909 cm- 1波数的特征峰较对照组向波数较小方向发生偏移。此外在1 598 cm- 1处， CH转基因杨木存在较强的峰位， 1 598cm- 1是细胞壁木质素苯环上氧键伸缩振动吸收峰，其增强表明木质
12、素苯环上基团发生变化，也表明酚羟基含量的升高 10 ，推测木质素CH调控基因活性的改变对细胞壁木质素的结构可能也存在一定影响。图1 转基因杨木与对照组杨木红外谱图Fig. 1 FTIR spectra of the transgenic poplars and control pcplars采用前人特征峰比值的分析方法，对转CH基因杨木与对照组杨木的化学成分含量的变化进行了分析。为了消除实验过程中木粉含量差异及操作误差对实验结果的影响，用I 1 508 I 1 79 ， I 1 508 I 1 25和I 1 508 I 1 70表征木质素含量50第11期 光谱学与光谱分析万方数据表1 杨木傅里
13、叶红外特征峰归属Table 1 Assignment of absorption of IR spectra speaks in poplars波数 cm- 1CK CH吸收峰归属 21 21羟基中的O H伸缩振动2 921 2 909 C H伸缩振动1 79 1 70非共轭羰基C O伸缩振动1 62 1 62共轭羰基C O伸缩振动1 509 1 507苯环骨架伸展振动1 6 1 6 C H弯曲振动，苯环碳骨架振动1 25 1 25 CH2剪式振动，弯曲振动1 79 1 79 C H伸缩(侧链CH )1 2 1 2 OH面内弯曲振动1 27 1 27苯环氧键伸缩振动1 159 1 160 C
14、O C伸缩振动1 051 1 05 C O伸缩振动，乙酰基中烷氧键伸缩振897 898异头碳振动表2 转基因杨木和对照组杨木傅里叶红外特征峰高度比值Table 2 The ratio of FTIR characteristic peak heightof the transgenic poplars and control poplars木质素综纤维素I 1 508 I 1 79 I 1 508 I 1 70 I 1 508 I 1 25 I 1 79 I 1 508 I 1 70 I 1 508CK 1. 10 0. 0 0. 56 0. 01 1. 68 0. 05 0. 91 0. 0
15、 1. 80 0. 0CH 1. 01 0. 0 0. 51 0. 02 1. 52 0. 05 0. 99 0. 0 1. 95 0. 06的变化， I 1 79 I 1 508和I 1 70 I 1 508表征综纤维素含量的变化。结果如表2所示，特征峰的测试结果均表明转基因杨木的木质素含量呈现下降趋势，其中I 1 508 I 1 78 ， I 1 508 I 1 25和I 1 508 I 1 70下降量相近约为8. 2% 9. 5% ，对应I 1 70 I 1 508 ，I 1 79 I 1 508测试结果表明其综纤维素的相对含量呈增加趋势。FTIR结果与前人研究结果一致，表明通过抑制CH
16、基因表达活性能够降低细胞壁木质素含量 6- 7 。2. 2 转基因杨木与对照杨木细胞壁木质素微区分布FTIR主要用于测定分析杨树木质部众多细胞壁的平均化学成分含量。显微切片结合激光共聚焦可以原位观测杨木单个细胞壁木质素微区含量分布情况，从而进一步探究转CH基因对杨木细胞壁木质素微区分布的影响。利用波长为88 nm蓝光可以定性观察木质素含量的微区分布差异，荧光亮度越大，表明木质素的密度越高、浓度越大。结果如图2所示，分别观察转基因杨木与对照组杨木激光共聚焦拍摄图片发现，转CH基因并没有改变杨木细胞壁木质素在细胞角隅处( CC)及细胞壁层的微区分布规律，如转CH基因杨木与对照组杨木均在其细胞角隅处
17、、复合胞间层( CM L)上有明显的光亮，此外在木射线处也有明显的一条亮线，表明转基因杨木与对照杨木都表现出了细胞角隅处木质素含量较高，其次是复合胞间层和次生壁( S2 ) ，如图2( c)单个纤维细胞放大图所示，这与其他木材细胞壁木质素微区分布规律是相一致的 1 。此外还发现无论是在细胞的角隅处还是在两个细胞相邻细胞壁，转基因杨木的荧光强度都弱于对照组杨木，这表明CH基因影响了转基因杨木细胞壁木质素的合成，导致其含量或浓度的降低，这与FTIR的分析结果也是相一致的。图2 激光共聚焦显微图, Bar= 20 m( a) :对照组杨木; ( b) :转基因杨木; ( c) :单个杨木纤维细胞放大
18、图Fig. 2 The microscopic images by CLSM ， Bar= 20 m( a) : Control group; ( b) : Transgenic poplar; ( c) : The magnified image of fiber cell of poplar wood除了激光共聚焦显微镜荧光的强弱可以判定木质素微区含量变化，组织化学染色法也可以从组织水平观察转CH基因对杨木不同木质素组成单元结构微区含量的影响。杨木细胞壁木质素主要由愈创木基结构单元( G)和紫丁香基结构单元( S)组成，含少量对羟苯基结构单元( H) 。 M ule染色主要是将木材细胞壁中
19、紫丁香基( S)木质素染成红色， W iesner染色则主要是将木材细胞壁中紫丁香基( S)和愈疮木基( G)木质素染成紫红色。 M ule染色结果如图( a)和( b)所示，对60光谱学与光谱分析 第7卷万方数据照组杨木与转CH基因杨木均呈红色，则说明转基因杨木纤维细胞S单元木质素含量未发生明显变化，且未发现纤维细胞S单元木质素沉积有明显区别。 W iesner染色结果如图( c)和( d)所示，由图可知，转CH基因杨树呈红色而对照组呈紫红色，表明两者纤维细胞木质素含量存在差异，推测可能是转CH基因杨木木质部细胞壁愈疮木基较对照杨木的减少。此外还发现两组杨木导管壁的颜色较纤维细胞深，结合图(
20、 a)和( b)中导管未被染色情况，说明导管壁层颜色深度差异主要由G单元木质素引起，且G单元木质素在细胞角隅和复合胞间层浓度大于纤维细胞次生壁的。图3 转基因杨木和对照组杨木组织化学染色图, Bar= 20 m( a) :对照组杨木M ule染色; ( b) :转基因杨木M ule染色; ( c) :对照组杨木W iesner染色;( d) :转基因杨木W iesner染色; F:纤维细胞; V:导管Fig. 3 The images of histochemistry staining Bar= 20 m( a) : Control poplar section with M ule sta
21、ining; ( b) : Transgenic poplar section with W iesner staining; ( c) : Control poplar section with M ulestaining; ( d) : Transgenic poplar section with W iesner staining; F: Fiber; V: Vessel 结 论采用FTIR， CLSM及组织化学染色法对转CH基因幼龄杨树及其对照组杨树的木质部细胞壁木质素含量及其微区分布进行了研究。 FTIR研究结果表明， CH基因活性下降使转C H基因杨木细胞壁木质素含量下降，但对其细
22、胞壁化学组成成分种类形成无明显影响; CLSM原位直接观测到转CH基因活性并未改变木质素在纤维细胞壁层、角隅处和胞间层的沉积规律，并且幼龄杨木木各细胞微区木质素浓度较对照组杨木质素浓度有所下降;组织化学染色结果进一步表明， CH基因活性的降低并没有改变杨木细胞壁上G和S木质素单体的沉积规律，但对纤维细胞和导管木质素单体含量分布均有一定影响。基于以上结果可知，对于较幼龄的转基因杨树应用FTIR， CLSM等光谱技术可以快速判定并测定其木质部细胞壁化学组成成分种类、微区分布及木质素含量。References 1 ZHANG Qi- wen， SU Xiao- hua(张绮文，苏晓华) . Dire
23、ctional Genetic Improvement of Poplar and Breeding of New and High Technology(杨树定向遗传改良及高新技术育种) . Beijing: China Forestry Publishing House(北京:中国林业出版社) ， 1999.70第11期 光谱学与光谱分析万方数据 2 Porth I， El- Kassaby Y A. Biotechnology Journal， 2015， 10( ) : 510. Vanholme R， M orreel K， Ralph J， et al. Current Opini
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25、) : 501. 7 Ralph J， Akiyama T， Kim H， et al. BioEnergy Research， 2012， 5( ) : 88. 8 Faix O. Holzforschung， 2009， 5( s1) : 21. 9 Zhou G， Taylor G， Polle A. Plant M ethods， 2011， 7( 1) : 9. 10 HUANG Rong- feng， L Jian- xiong， CAO Yong- jian， et al(黄荣凤，吕建雄，曹永建，等) . Journal of Beijing Forestry Universit
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27、m X， Carrillo F， Nogu s F， et al. Polymer Degradation & Stability， 200， 80( ) : 5.Analysis of Content and Distribution of Lignin in Cell W all ofTransgenic Poplar with Fourier Infrared Spectrun ( FTIR) andConfocal Laser Scanning M icroscopy ( CLSM )LIU Cang- wei1 ， SU M ing- lei1， 2 ， ZHOU Xian- wu1
28、 ， ZHAO Rong- jun1 ， LU Jian- xiong1 ， W ANG Yu- rong1， 21. Research Institute of W ood Research， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China2. Research Institute of Forestry New Technology， Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， ChinaAbstract Lignin genetic engineering can effectively
29、reduce the lignin content ofthe cell walls in poplars， while improving utiliza-tion characteristic of poplars as the lignocellulosic material. In this paper， the transgenic poplars with CH downregulated andcontrol poplars were selected. Fourier transform infrared ( FTIR) spectroscopic was used to qu
30、ickly characterize the lignin con-tent and the other cell wall constituents of transgenic poplars with CH- downregulated. CLSM and histochemistry reaction wereused to reveal the influence of lignin content reduction on their micro- area distribution in situ. The results showed that the FTIRspectrum
31、shape， the number and wavenumbers of characteristic bands of transgenic poplars and control poplars were similarwhich means that the reduction of CH activity had no effect on the chemical composition of poplar cell walls. However， theheight ratios of I 1 508 I 1 79 ， I 1 508 I 1 25 ， and I 1 508 I 1
32、 70 associated with lignin content reduced 8. 2% to 9. 5% in transgenic pop-lars compared with control poplars. The difference in intensity of spectrum peaks between the transgenic poplars and the controlpoplars illustrated that the CH- downregulated can change the cell wall constituents content of
33、the transgenic poplars. TheCLSM images showed that the micro- area distribution trends of the lignin of the cell walls in transgenic poplars and control pop-lars were similar， and the sequence of lignin distribution was the cell wall corner the middle lamellar the second cell wall， andthe images als
34、o showed the lower lignin content of the cell walls in transgenic poplars than that of the control group. TheW iesner and M ule staining images also showed that S lignin monomer was uniformly distributed in fiber cell walls of the twokinds of poplars， and the G lignin monomer deposition was nonhomog
35、eneous， the sequence was also the cell wall corner themiddle lamellar the second cell wall. These results also illustrated that reducing the activity of CH gene had no influence ondistribution trend of G and S lignin monomer， but changed the lignin monomer content of the cell walls of fiber and vessel intransgenic poplars.Keywords Transgenic poplar; Lignin; FTIR; CLSM( Received Jan. 18， 2017; accepted M ay 20， 2017) Corresponding author80光谱学与光谱分析 第7卷万方数据