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1、98中国烟草学报Acta Tabacaria Sinica http：ycxbtobaccoorgcndoi：1016472qchinatobacco2016210过表达天山雪莲SikCDPKl基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探田晓涵，庞学兵，祝建波，朱新霞石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，新疆石河子832000摘要：钙依赖型蛋白激酶(calciumdependent protein kinases，CDPKs)在植物参与非生物胁迫信号响应中发挥着重要作用。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了天山雪莲钙依赖性蛋白激酶基因kCDPKl在4低温胁迫处理下的表达量，发现低温胁迫可以
2、诱导天山雪莲内源SikCDPKl基因表达，且在处理3 h表达量迅速积累达到最高值。将SikCDPKl基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pCAMBIA2300上，利用农杆菌介导法转化烟草NC89，发现转基因烟草植株在低温胁迫后，耐低温能力明显增强；脯氨酸、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性均高于非转基因烟草植株；丙二醛含量和相对电导率均低于非转基因烟草植株。上述研究结果表明，SikCDPKl基因可以通过积累渗透调节物质、增强抗氧化酶活性和维持细胞膜稳定性来提高植物的耐低温能力。关键词：天山雪莲；SikCDPKl基因；低温；表达分析：转基因引用本文：田晓涵，庞
3、学兵，祝建波，等过表达天山雪莲SikCDPKl基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探J】中国烟草学报，2016，22(6)低温、干旱、盐渍、洪涝等非生物逆境胁迫是制约农作物产量和品质的主要限制因素【1，在长期的进化过程中，植物形成了复杂而又精细的信号转导途径，从而保护自身免受胁迫伤害。在植物细胞的信号转导过程中，钙离子作为第二信使，在植物生长发育和感知环境刺激的过程中扮演了非常重要的角色，其中钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent proteinkinasesCDPKs)是一类广泛存在于植物中的SerThr类蛋白激酶，可不需钙调素而被钙信号直接激活，对植物感受钙信号并在细胞内放大
4、信号和传递信号起关键作用21。白1982年在豌豆【3】中发现钙依赖蛋白激酶至今，陆续又在拟南芥嗍、水稻嘲、小麦嘲、烟草用、玉米81、黄瓜嘲等多种植物中发现，是植物中研究较多、了解较清楚的一类蛋白激酶。在转录水平上，CDPKs基因能够被多种胁迫信号诱导表达。过表达拟南芥AtCDPKl基因能明显提高转基因拟南芥在低温、高盐和ABA胁迫下的耐受能力n 01；低温能诱导胡杨PeCPKIO基因的表达，PeCPKIO在拟南芥中异源表达可以提高转基因拟南芥的抗寒性口；低温胁迫下，玉米ZmC麟J基因表达上调，ZmCPKl可以抑制冷胁迫诱导的Zmerf3基因的表达1 21；低温能诱导水稻伪，3基因的表达，在伽C
5、D尸!肼3启动子区发现了低温应答元件L1、RECOREATCORl5【l引。天山雪莲(Sasussured involucrata Karet Ki0能够在常年积雪、气候多变、昼夜温差悬殊的海拔2400m至4100 m的山坡、山谷和石缝中生长，完成生活史，是优异的抗逆资源。本研究利用前期研究获得的天山雪莲SikCDPKl基因，构建组成型表达载体导入烟草，测定低温胁迫下转基因植株体内渗透调节物质、抗氧化酶活性和细胞膜稳定性交化，探讨在烟草中过表达天山雪莲龇CDPKJ基因对低温逆境胁迫的响应机制。1材料和方法11材料111植物材料天山雪莲(Sasussured involucrata Karet
6、Kir)，烟草(Nicotiana tabacum L)品种NC89均由新疆石河子基金项目：新疆生产建设兵团“新疆特色植物基因资源研究与利用创新团队”(2014CC005)；石河子大学育种专项(gxjs2014一yz04)作者简介：田晓涵(1990一)，硕士，研究方向为环境生物技术，Email：723745781qqcorn通讯作者：朱新霞(1968一)，Emaih 302641316qqtom收稿日期：20160612万方数据田晓涵等过表达天山雪莲SikCDPKl基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探大学农业生物技术重点实验室保存。112菌株及试剂大肠杆菌DH5a、农杆菌GV3101、植物表
7、达载体pCAMBIA2300由本实验室保存。植物总RNA提取试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司，cDNA合成试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司，限制性内切酶、T4DNAligase购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，SYBR Green I Master Mix购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，其他试剂均为分析纯。引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成，本实验所用引物见表1，酶切位点用下划线标注。表1引物序列Tab1 Primer sequences12方法121 低温胁迫下天山雪莲内源SikCDPKl基因表达分析将天山雪莲无菌苗置于一4。C光照培养箱进行低温胁迫处理，分别取处理
8、0(CK)、1、3、6、12、24h叶片样品，液氮速冻，70保存。分别提取对照和不同时间处理的雪莲RNA，以cDNA为模板，对SikCDPKl基因在低温胁迫下的表达进行分析。以天山雪莲看家基因GAPDH作为内参基因，按照Roche公司SYBR Green I Master Mix试剂盒说明书操作，利用Light Cycler480 II PCR仪(Roche)进行扩增。反应程序为94预变性5min；94变性15s，62退火30s，72延伸30s，40个循环。试验进行3次重复，取平均值，结果采用2。c法对数据进行分析。122 pCAMBIA2300一SikCDPKl植物表达载体的构建用BamHI
9、和Sall分别双酶切植物表达载体pCAMBIA2300和阳性克隆载体pMDl9SikCDPKl，用1琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的基因和载体大片段。经T。DNA连接酶16。C过夜连接，重组子转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经菌落PCR、双酶切鉴定，阳性克隆命名为pCAMBIA2300一SikCDPKl，电击法转入农杆菌GV3 101。123烟草转化及分子鉴定将含有质粒pCAMBIA2300一SikCDPKl的农杆菌通过叶盘法转化无菌烟草NC89，将侵染的烟草叶片置于含有80肛gmL。1卡那霉素抗性的培养基上进行初步筛选，待叶边缘的愈伤组织逐渐分化出丛生芽，并长至23 cm左右时，置于卡那霉素抗
10、性的生根培养基中，待根系发达后移入营养土中。经过1520d左右，改良CTAB法提取烟草基因组DNA，进行PCR检测，提取PCR阳性的转化株和受体烟草的总RNA，RT-PCR法检测彤后a)尸KJ基因的转录水平。124转SikCDPKl基因烟草低温胁迫实验选取生长旺盛、大小一致的野生型和T。代转基因烟草株系(1inel、line2)各3株，放入一4的人工气候箱进行低温胁迫处理0、3、6、9、12h，然后将植株放入25培养箱恢复24h，记录各阶段烟草的形态变化，并在不同处理阶段分别取样，70冷冻保存。万方数据100 中国烟草学报Acta Tabacaria Sinica 201 6 V0122 No
11、6125生理指标的测定采用李合生【14】的方法测定野生型和转基因型株系烟草叶片在低温胁迫处理0、3、6、9、12h后的脯氨酸(Proline)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白含量、相对电导率及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性变化，实验进行生物学重复3次。126数据分析实验数据采用SPSSl70软件进行统计分析，以LSD法进行差异显著性分析，显著性水平设定为P005(显著水平1和P001(极显著水平)，采用Excel软件作图。2结果与分析21天山雪莲SikCDPKl基因受低温胁迫诱导表达qRT-PCR结果表明，低温胁迫能够改变雪莲内源SikCDPKl基因的表达量(图1)。4胁迫处
12、理1 h，SikCDPKl基因表达量急速下降，而后表达量迅速上升，处理3h时达到最大值，为对照的58倍；随着处理时间的延长，表达量降为初始水平；12h时表达量降至最低，仅为对照表达量的96；24h时表达量又开始上升，为对照的179倍，推测SikCDPKl基因在低温胁迫中起作用。本研究中胁迫处理1 h的表达量要低于未胁迫的表达量，这可能是由于天山雪莲在一4C环境呈现应激反应导致。姒1i持按f川I jIlou tcnlpClatlttc dut。lH、”图1低温胁迫下SikCDPKl基因的表达分析Fig1 Analysis of SikCDPKl gene expression under col
13、d stress22转基因烟草的获得及鉴定将SikCDPKl基因插入到由组成型CaMV35S启动子控制的表达载体pCAMBIA2300上(图2)。SikCDPKl基因特异引物PCR检测阳性转化株(图3)。提取鉴定为阳性植株叶片中的RNA，进行半定图2载体pCAMBIA2300一SikCDPKl构建简图Fig2 Figure of pCAMBIA2300一SikCDPKl vector注：M：DL2000 DNAMarker；泳道1-3：WT；泳道412：转化植株Note：M：DL2000 DNA Marker；Lane 1-3：Wild type tobacco；Lanel一1 2：Trans
14、genic plants图3转SikCDPKl基因烟草的PCR和RT-PCR检测Fig3 PCR and RTPCR identification of the SikCDPKl transgenicplants量表达分析，结果表明SikCDPKl基因在过表达烟草中可以正常转录(图3)，其中泳道9和10分别命名为Linel、Line2，用于后续实验。23转基因烟草耐低温能力分析231低温胁迫下转基因烟草表型变化将野生型和表达量高的转基因株系放入一4人工气候箱内进行低温胁迫处理。如图4 A所示，室温生长状态下，野生型和转基因株系没有明显表型差异；置于一4培养箱3 h后，野生型烟草叶片轻度下垂，表
15、现出轻微冷害特征，转基因烟草无明显表型变化(图4 B)；低温胁迫6 h后，野生型烟草冷害症状愈发明显，叶片中度萎蔫，出现伤斑，而转基因烟草依旧未出现明显变化(图4 C)；低温胁迫9 h后，野生型烟草基本完全萎蔫，水渍状明显，只有顶部小叶芽还有生命体征，而转基因烟草此时叶片轻微疲软(图4 D)；低温胁迫12 h后，野生型烟草完全萎蔫，而转基因烟草叶片卷曲并下垂，萎蔫严重(图4 E)：室温恢复24 h后，野生型烟草无明显恢复现象，而转基因烟草叶片开始伸展，逐渐恢复(图4 F)。232低温胁迫下转基因烟草生理指标变化对低温胁迫不同处理时间的野生型和转基因烟草分别进行了脯氨酸、可溶性蛋白、MDA含量，
16、POD、SOD活性和相对电导率的测定。结果表明，低温处理前，野生型和转基因型烟草脯氨酸含量差别不大，随着低温胁迫时间的增加，脯氨酸含量呈现上升一下降一上升一下降的趋势，转基万方数据田晓涵等过表达天山雪莲SikCDPKl基因提高转基因烟草耐低温能力的机制初探 101图4野生型和转基因烟草低温胁迫下的形态特征Fig4 Phenotypes of WT1ine 1 and line 2 under cold stressi飞ri o【1。LlLJo ； 6 9 12 ，m复24低温持缘8j闻-Lcwtdm曲d黧1日i 001塑苫o ooj=苫 3E要皇0 1芝#蜒；昙曩t 斟一一萍7卜Si；CD?搿
17、o 3 6 5 12 j复低温持续时间Low temperatwe缸2t0Ii0o 3 6 9 12恢复_1i韫持续时间jL3wl口danedg：ation一、T十SmCDPK-t,-耵f孓kCDPKji三i鹈皿二i2主o 3 6 9 12 恢复24低温持续时间b0w娃叩啦哦血rn鞫0 L-LLLL、L一0 ： 5 9 12复14S温持续时间tLoutl锄口a缸lredmatioBj c。1。11L_o 3 6 9 12 一目复2低温持续8寸f叽L0wtempermure dmaficn一一n了-t-SlcDpR】一-盯十SkCDPK、盯卜S上C强注：(A)脯氨酸含量，(B)可溶性蛋白含量，(
18、c)丙二醛含量，(D)POD活性，(E)SOD活性，(F)相对电导率；+和+分别表示相关性达显著(PO05)和极显著CPO01)水平。Note：(A)Proline content，(B)Soluble protein content，(C)MDA content，(D)POD activity,(E)SOD activity,(F)Relative electrical conductivity+and+indicate significant correlation(PO05)and very significant correlation(|PO01)respectively图5低温胁迫
19、对野生型(wT)和转SikCDPKl基因烟草部分生理指标的影响Fig5 Effect of cold sffess on physiological contentis of WT and SikCDPKl tobacco。 ：，_1，-，；1-一溅一万方数据102 中国烟草学报Acta Tabacaria Sinica 2016 V0122 No6因植株脯氨酸含量高于野生型(图5 A)，在3 h和9 h之间达到极显著水平。说明低温胁迫下，转基因烟草可以积累更多的脯氨酸，从而提高植株的耐冷性。低温处理前，野生型和转基因型烟草可溶性蛋白含量差别较小，随着低温胁迫时间的增加，转基因烟草叶片可溶性蛋
20、白含量增加幅度大于野生型(图5 B)，在6 h后达到极显著水平；室温恢复24 h后，野生型烟草可溶性蛋白含量仍在增加，而转基因烟草开始逐渐下降。说明在低温胁迫下，转基因烟草叶片可溶性蛋白含量增加使细胞液浓度增大，从而增强了植株的抗寒性。低温处理前，野生型和转基因型烟草MDA含量差别不大，随着低温胁迫时间的延长，野生型和转基因烟草MDA含量均呈现上升趋势(图5 C)，转基因植株MDA含量低于野生型，在9 h时达到极显著水平；在室温恢复阶段MDA含量开始下降。说明低温胁迫下转基因植株细胞膜受损程度较轻。在正常生长状态下，野生型和转基因烟草POD和SOD活性无明显差异(图5 D，E)，随着低温胁迫时
21、间的延长，野生型和转基因烟草POD活性持续上升，在冷处理6 h达到最高值，分别为初始的216倍和229倍，随后开始下降，在恢复阶段又开始上升；而SOD活性处于持续上升状态，转基因烟草SOD活性增长幅度高于野生型，在恢复24 h后开始下降。说明低温胁迫下，转基因烟草拥有更高的POD和SOD活性，对细胞膜能起到保护作用，从而增强植株的抗寒性。随着胁迫时间的延长，野生型和转基因烟草相对电导率均呈明显上升趋势f图5 F)，在室温恢复24 h后转基因烟草相对电导率开始下降，而CK仍保持上升趋势；整个过程转基因植株相对电导率显著低于野生型，其中第6 h和第9 h达到极显著水平。说明低温胁迫下，转基因植株细
22、胞膜透性变化相对较小，胞质外渗程度较低，细胞膜受损较轻。本试验结果显示SikCDPKl基因显著提高了转基因烟草的耐低温能力。CDPKs基因家族成员较多，且不同CDPK基因成员对低温胁迫的响应模式可能不同，后续还需要发掘并研究CDPK低温信号转导途径的关键分子、筛选出下游有价值的与SikCDPKl相互作用的蛋白等，从而更好的揭示SikCDPKl基因的抗逆分子机制。参考文献1】Lobell D B，Wblfram S，Justin C RClimate trends andglobal crop production since 1980【J】Science，2011，333(6042)：6166
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33、bing，ZHU Jianbo，ZHU XinxiaKey Laboratory ofAgricultural Biotechnology，College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang UygurAutonomous Region，ChinaAbstract：CDPKs(calciumdependent protein kinases)play a very important role in abiotic stress responseRealtime PCR was usedto analyze ex
34、pression of SikCDPKl gene to cold stress in Saussurea involucrataResults showed that endogenous SikCDPKl gene wasinduced by cold stress，and SikCDPKl expression reached the peak after 3 hThe SikCDPKl gene was constructed on dicotyledonoustransformation vector pCAMBIA2300，which was composed of a stron
35、g promoter of CaMV35S，and the gene was introduced into tobaccoNC89 by Agrobacturium-mediated transformation method to identify the gene fianctionIt turned out that after cold stresscold resistanceof transgenic tobacco plants was significantly enhanced，and the content of proline，solubleprotein and th
36、e activities of POD and SOD intransgenic tobacco plants were higher than that ofwild type，whereas the MDA content and electrolyte leakage were lower than that ofwildtype plantsThese results indicated that SikCDPKl gene could enhance the resistance of plants to cold stress by accumulating more osmoti
37、cadjustment substances，enhancing the activity ofthe antioxidant system and maintaining the stability ofthe cell membraneKeywords：Sasussured involucrata Karet Kir；SikCDPKl；low temperature；expression analysis；transgenosisCitation：TIAN Xiaohan，PANG Xuebing，ZHU Jianbo，et a1Effect of overexpression of Sa
38、ussurea involucrata SikCDPKl gene onimproving cold tolerance in transgenic tobaccoJ】Acta Tabacaria Sinica，2016，22(6)相关论文推荐转OjDREB基因提高烟草耐盐能力的研究【作者】李聪，郭梦阳，韩烈保中国烟草学报，2012年第4期摘要：利用农杆菌介导法将沿阶草OjDREB基因转入烟草植株中。通过RT-PCR检测，获得转OjDREB基因的烟草植株。以400mmolL NaCl处理转基因烟草植株和野生型对照10 d后，结果显示：转基因烟草体内叶绿素含量和SOD酶活性是野生型对照的1698倍和19l倍；体内的MDA含量和电解质渗透率分别是野生型对照的5923和5507，说明过量表达OjDREB基因可以提高烟草的耐盐能力。关键词：沿阶草；OjDREB基因：耐盐性；烟草万方数据