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1、中国烟草学报Acta Tabacaria Sinica http：ycxbtobaccoorgcndoi：10164720chinatobacco2016072生物技术过表达Layb基因对烟草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响杨永霞，张嘉炜，张洪映，张松涛，贾宏防，崔红国家烟草栽培生理生化研究基地河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号450002摘要：为揭示类胡萝卜素代谢关键基因番茄红素D环化酶基因(Lycopene betacyclase，Lcy-b)对类胡萝卜素及香气物质代谢的影响，通过同源克隆法获得烟草品种K326 Lcy-b基因eDNA全长序列。采用农杆菌介导法导入烟草，测定Lcy-b过
2、表达对类胡萝卜素各组分及烤后样香气物质含量的影响。序列分析表明：K326 Lcyb基因包含一个1503bp的开放读码框fORF)，编码500个氨基酸。预测蛋白二级结构以仅螺旋和无规则卷曲为主，蛋白质分子量为5606KDa，理论等电点(pI)为698。部分过表达阳性植株Lcyb基因的表达量显著高于对照，类胡萝卜素组分中的B胡萝卜素、新黄质、紫黄质比例增加，叶黄素所占比例降低。过表达植株烤后样B胡萝卜素降解产物显著高于对照，而叶黄素降解产物则低于K326对照或与对照相当。研究结果说明Lcy-b过表达可以改变烟草类胡萝卜素组分比例，影响烤后烟叶香气物质含量。关键词：烟草；Lcy-b基因；过表达；类胡
3、萝卜素；香气物质引用本文：杨永霞，张嘉炜，张洪映，等过表达Lcy-b基因对烟草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响J丁中国烟草学报，201622(3)类胡萝卜素是重要的光辅助色素，在光吸收和防止光氧化方面起着重要作用1-2o类胡萝卜素是烟草许多生理活性物质尤其是重要致香物质的前体物，其降解产物的种类及含量与烟叶品质有关3】。在烟叶总挥发性香气成分中，类胡萝卜素降解产生的香味物质是影响烟叶香气质和香气量的重要组分【4】。关于烟草类胡萝卜素的代谢途径已有详细综述【5】，在类胡萝卜素生物合成途径中，番茄红素可以在番茄红素B环化酶(LCY-b)和番茄红素环化酶(LCY-)的催化下发生环化作用，形成13胡萝卜
4、素(B分支)和0【胡萝卜素(0【分支)(见图1)，这是类胡萝卜素合成途径中的关键分支点，a分支最终生成叶黄素，B分支最终生成紫黄质、新黄质等产物6】。研究表明，Lcy-b基因编码番茄红素B环化酶，过表达Lcyb基因烟草的耐盐和耐旱能力提高7培1；过表达Lcy-b基因番茄的番茄红素含量减少；Lcy-b转录后基因沉默则会导致Lcyb基因表达下调、B胡萝卜素和叶黄素含量降低9-10o强光会诱导小麦Lcy-b基因强烈表达，D胡萝卜素含量增加111。而0【支路编码番茄红素环化酶的LcyE基因被干扰时下游产物叶黄素明显下降，处于p支路的p胡萝卜素含量却有所增长，植物的抗盐性能力也提高12o对两条支路关键基
5、因的调控会影响支路(上)下游的物质代谢，调控Lcy-b基因对烟草中类胡萝卜素降解产生的香气物质的影响未见相关报道。本研究从烟草品种K326中克隆了Lcy-b基因，采用infusion方法构建Lcy-b基因过表达载体，农杆菌介导法转化烟草植株，探讨Lcyb过表达对烟草香气物质代谢的影响，从而为调控烟草类胡萝卜素代谢，改善烟草香气品质提供理论基础。紫黄质新黄质。_11。一叶黄素图1植物类胡萝卜素合成途径示意图Fig1 Schematic diagram carotenoid biosynthesis pathway in plants基金项目：中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项浓香型项目(1
6、10200902045TS01)作者简介：杨永霞(1980一)，博士，讲师，主要从事烟草生物技术研宄，Email：yyx624126corn通讯作者：崔红(1966一)。教授，主要从事烟草生物技术研究，Email：cuihonger_13163COrn收稿日期：20160302噼万方数据杨永霞等过表达Lcy-b基因对烟草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响 951材料和方法11 Lcyb基因的克隆及序列分析111 Lcyb基因的克隆试验材料为烟草品种K326，按照Invitrogen公司TRIzol RNA提取方法及反转录说明书提取烟草叶片总RNA，并反转录为cDNA。参考GenBank收录的烟草品
7、种Samsun Lcyb基因序列(X817871)，采用Primer Premier 50软件设计烟草品种K326 Lcyb全长基因扩增引物F1R1(引物序列见表1)。PCR程序为：94。C 5 min；94C 30 S，5630 S，7250 S，35个循环，7210 min。PCR扩增产物采用1琼脂糖凝胶电泳分离。回收纯化后送Invitrogen公司测序。112 Lcyb基因的生物信息学分析利用NCBI网站的BLAST和ORF finder进行核苷酸序列比较和开放阅读框分析。采用DNAstar和Expasy Protparam软件推测该基因编码的氨基酸序列、蛋白质分子量和等电点。利用Con
8、served Domains和SMART软件进行蛋白质结构功能域预测。使用在线工具SOPMA进行蛋白质的二级结构预测。12过表达载体的构建及转基因植株的获得采用infusion方法构建Lcyb基因过表达载体pCAMBIANPT-Lcyb， 利用Primer Premier 50设计引物F2R2(表1)。引物的5末端分别包含与载体末端相同的1716个碱基序列，引物的3末端包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列。以测序正确的阳性菌落摇菌扩繁后提取的pMDl9T-Lcyb质粒为模版，扩增含有SpeI和EcoR I酶切位点的K326 Lcyb基因，用限制性内切酶Spe I-HF和EcoR I-HF双酶
9、切pCAMBIANPT载体，回收目的片段后连接，得到pCAMBIANPT-Lcyb过表达载体重组质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5 c【，挑选阳性克隆，菌落PCR及测序正确后，冻融法将构建好的pCAMBIANPT-Lcyb过表达载体转到农杆菌LBA4404中，在含有利福平、卡那霉素的YEB固体培养基上筛选，菌落PCR鉴定后叶盘法浸染烟草品种K326叶片。共培养基上暗培养23 d后，用无菌水(含cef500)洗苗，在含有卡那霉素的分化培养基上进行阳性筛选，待芽长到12 cm时，移至含卡那霉素的生根培养基上培养，得到T0代幼苗。将幼苗移到营养土中培养。13转基因植株的检测131转基因植株DNA的P
10、CR鉴定采用CTAB法提取转化苗及未转基因对照烟苗DNA，以其为模板，用包含Lcyb基因起始密码子的引物F3和过表达载体序列的检测引物R3进行PCR验证，Lcyb过表达质粒DNA为阳性对照，未转化植株叶片DNA为阴性对照，检测T0代转化苗中Lcyb基因的转化情况。132转基因植株Lcyb基因的表达分析根据K326 Lcyb基因cDNA序列设计Real TimePCR引物F4R4，转基因叶片总RNA的反转录cDNA为模板，以烟草组成型表达的L25基因fF5R51为内参。参照Invitrogen公司的Real MasterMix(SYBR Green)试剂盒说明书进行反转录实时定量PCR(Reve
11、rse Transcription Quantitative RealTimePCR，RT-qPCR)，每个样品3次重复。RT-qPCR数据采用2“算法进行分析，假设目的基因表达量是对照的N倍，N=2以c，Ct=Treat(Ct样品CtL25)CK(Ct样品一Ct L25)。表1引物序列Tab1 Primer sequences型黧 引物序列(5，-3)名称 “1”。JF1 AIATGGATACATT(n1GAAAACCRl TGAACAAG&rICrl3G1：c蝴TCF2 ACGG麟氏CtGK0nca西QG妪氏ca矾GGA j、CR2 CA(mC(凇A ACTAG，ITCATTCl(门(rC
12、CTGTA ACF3 A阿GA队C舶盯GIrIGAAAACCR3 GCCAGllAGlTrCGTrI了rrCACF4 1=c钆蛇1：c虹GGTI胡_ITGGGIGGR4(1GTCCTCIrCA Ar姗TF5 CCCCAAGl：ACCCrCGTR5 GClrrI了r】EGTCCCArA14烟叶质体色素及香气成分的检测方法将转基因阳性株系的无菌苗进行快繁，叶片剪成约1 cm2的小块，置于分化培养基(MS+IA，+BA。，+Kan，。)上28进行培养，每15 d左右换一次培养基。待转基因苗不定芽长到12cm时，转移到生根培养基(MS+Kan30+NAAo】)上生根，生根后长出78片叶时转移到含有育苗
13、基质的漂浮盘上进行培养，之后将快繁后的T0代转基因植株移栽至大田，以K326做对照，用于质体色素和香气成分的检测。万方数据96 中国烟草学报Acta Tabacaria Sinica 2016 V0122 No3141烟叶质体色素含量的检测在烟株旺长期和成熟期，取中部叶，80冰箱冷冻后，用冻干机进行冷冻干燥处理，参照中华人民共和国烟草行业标准YCT3822010【13】烟草及烟草制品中质体色素的高效液相色谱法测定。142烤后样香气成分的检测每个转基因T0代株系选取烟株长势、烟叶的叶色、叶片大小相对一致、成熟度基本相同的中部叶片，采用热动密集烤房，以三段式烘烤工艺烟夹挂杆烘烤。烘烤参数：变黄期3
14、642，36h：定色期4255，50h；干筋期：5572，5060h。烤后样选取C3F烟叶，参考文献14】采用“水蒸气蒸馏、二氯甲烷溶剂萃取”法进行前处理，用HP5890II5972气质连用仪对样品采用内标法进行定性分析。15数据处理试验数据采用SPSSl70软件进行单因素方差分析，由新复极差法分析均值差异的显著性，显著性水平P005，以a、b、c、d和e表示其差异性，数字后不含有相同字母表示差异有统计学意义；采用Excel 2013软件绘图制表。2结果与分析21 Lcy易基因的克隆及序列分析211 Lcyb基因的克隆采用TRIzol RNA提取法获得28S和185比例较好的K326 RNA，
15、同源克隆法得到1600 bp左右的片段(图2)，回收相应片段，测序验证后获得基因全长序列1525 bp。图2 Lc3，一b扩增电泳检测图Fig2 PCR amplification of Lcy-b212 Lcy-b基因的生物信息学分析对克隆获得的序列进行ORF finder分析，该序列包含5端UTR 2 bp，3端UTR 20 bp，含有一个1503bp的完整开放读码框(ORF)，GC含量为4125。与NCBI收录的烟草品种Samsun(X817871)和Virginia Gol础1(KC484706)；ycb基因相似性均为99，仅有一个碱基的差异，证明该序列为K326咖b基因。生物信息学分
16、析预测该序列编码500个氨基酸，其中碱性氨基酸(Arg、Lys)57个，强酸性氨基酸(Asp，Glu)59个，蛋白质分子量为5606KDa，理论等电点(pI)为698。应用Conserved Domains在线分析软件预测该基因编码的蛋白含有LCY-b蛋白家族保守结构域。详见图3。嚣甚强鬻ts-。-；鲁；宣；言盏高盎；昌；j昌宣lsuper(amiliesMu1l d0121alm LiI-11_舅蚺”鲤山iI iiifjm-图3 LCY-b蛋白质结构域分析Fig3 Protein domain analysis of LCYb蛋白二级结构预测表明，K326 LCY-b蛋白质二级结构中含有35
17、的0【螺旋、218的延伸链、94的13折叠，338的无规则卷曲。LCY-b蛋白二级结构以cc螺旋和无规则卷曲为主。22转基因烟草植株的阳性检测当转化苗长到810片叶时，提取全基因组DNA，以Lcy-b基因检测引物F3R3进行PCR检测，有6个株系扩增片段长度符合预期大小(1909bp，其中包含基因全长序列1503 bp，过表达载体序列406 bp)(如图4)。提取转基因阳性植株叶片总RNA，反转录为cDNA后，应用RT-qPCR分析Lcy。b基因的表达，六个转基因株系中2、3、5 Lcyb基因表达量显著高于K326对照，株系4、6表达量显著低于K326对照，这可能是由于转基因插入位点的随机性，
18、插入位点破坏了内源基因的完整性，进而导致内源基因表达量降低(如图5)。注：质粒：pCAMBIANPT-上哕一良K326：对照：1-6：转基因株系。图4转基因植株的DNA检测Fig4 DNA detection of transgenic plants万方数据杨永霞等过表达Lcyb基因对烟草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响 97CK 2 3 4 5 6i屯图中末标有相同小写字母青表示处理间差异有统计学意义(P005)。图5 Lc)，一b过表达株系的基因表达检测Fig5 Expression analysis ofLcy-b in transgenic plants23转基因株系的类胡萝卜素含量及烤
19、后样中性致香物分析选取过表达成功的转基因株系2、3、5，检测生长发育过程中转基因烟株中部叶的类胡萝卜素含量，测定烤后样中性致香物含量。231类胡萝卜素含量变化由图6可知，除转基因株系3外，旺长期转基因各株系类胡萝卜素总量显著高于未转基因对照，成熟期差异不显著。从类胡萝卜素各组分来看，旺长期转基因中13胡萝卜素、新黄质、紫黄质含量均高于K326，株系2和5均达显著水平。旺长期叶黄素含量株系2差异不明显，株系3显著低于对照。成熟期转基因株系3叶黄素含量显著低于K326对照，其余株系类胡萝卜素各组分与K326差异不显著。O30252詈02、强O 15如喀01=fi砬：菇0 050 90 8PO7口E
20、 06、O5墙04挪03褪020 1O注：图中未标有相同小写字母者表示处理间差异有统计学意义(JDO05)。图6转基因株系类胡萝卜素含量Fig6 Carotenoid contents in transgenic plantsb口E一砻托舔L秘罩q万方数据中国烟草学报Acta Tabacaria Sinica 2016 V0122 No3232类胡萝卜素组分变化比较类胡萝t-素各组分分析结果如图7所示，在旺长期，各株系B胡萝卜素叶黄素、紫黄质叶黄素和新黄质叶黄素均显著高于CK。成熟期，B。胡萝卜素叶黄素、新黄质叶黄素与CK差异不明显，株系2和3的紫黄质叶黄素显著高于CK。结合对类l 8l6糕l
21、 4孥，z蠢 1酶d-O 8宰06q04O 2O胡萝b素各组分含量的分析结果可知，Lcyb基因的过表达提高了类胡萝卜素中B胡萝卜素、新黄质、紫黄质的组分比例和含量；此外，过表达株系叶黄素含量虽然总体变化不明显，但是由于类胡萝卜素其它组分增加，导致叶黄素在类胡萝卜素组分中所占的比例降低。06b05王a 04_ 黼a一椒03言 一_l瓤02黼0 1OCK 2 5CK 2 3 5“b一-? null期万方数据杨永霞等过表达Lcyb基因对烟草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响 99003结论与讨论CK605040墨30案20r悔100注：图中未标有相同小写字母者表示处理间差异有统计学意义(P005)。B胡
22、萝b素降解产物代表物质：B一二氢大马酮、B环柠檬醛、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯叶黄素降解产物代表物质：巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2、巨豆三烯酮3、巨豆三烯酮4。图8转基因株系香气物质含量Fig8 Content of aroma substances in transgenic plantsZ,ycb基因是烟叶类胡萝卜素合成途径p一分支中合成B胡萝卜素、紫黄质、新黄质的关键基因，其中p胡萝卜素由丫一胡萝卜素在Lcyb基因作用下直接形成，推测Z,ycb基因的过表达会影响烟叶类胡萝卜素合成途径中p支路上相关产物的合成，使p胡萝卜素、紫黄质、新黄质含量提高，导致类胡萝b素组分的变化。基于此假设，本研究
23、采用同源克隆法克隆了烟草Lcyb基因，并对其进行生物信息学分析，结果发现K326 Lcyb基因包含一个1503 bp的开放读码框fORF)，与香料烟巴斯玛和烤烟弗吉尼亚品种的Lcy-b基因仅有一个碱基的差异，该基因编码500个氨基酸，预测蛋白质分子量分别为5606 KDa，理论等电点(pI)为698。蛋白二级结构预测显示以0【螺旋和无规则卷曲为主。过表达Lcyb基因烟草植株的荧光定量PCR结果显示，株系2、3、5的Lcy-b基因表达量显著提高，并在旺长期相应的提高了类胡萝卜素总量及p分支代谢产物p一胡萝卜素、新黄质、紫黄质的含量及组分比例，其中对B胡萝卜素含量的影响最为显著，而c【一分支代谢产
24、物叶黄素的含量(及组分比例)不变或者减少。已有的研究表明，植物通过控制LCY-b和LCY-e两种环化酶的相对数量以及相对活性来调节不同具环类胡萝卜素的数量、组分及种类1 51，而LCY-b酶在两条环化途径中起主导作用16-17,植物中过表达Lcyb基因可能会导致番茄红素含量减少，0【分支LCY-e底物量减少，进而影响下游代谢产物叶黄素的含量。对烤后样香气成分的分析表明，Lcyb基因过表达株系的8一胡萝卜素降解产物D二氢大马酮、p环柠檬醛、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯等明显增加。而叶黄素降解产物巨豆三烯酮(四种同分异构体)含量降低或者无显著变化。证实Lcyb基因过表达可以改变类胡萝卜素合成途径p分
25、支和cc一分支代谢产物的比例，进而影响烤后样类胡萝卜素类降解产物香气物质的含量。本研究还发现，瑚咖啪瑚湖枷姗姗如舳加如如加m0b号蛹硇霉址鐾世粼懈、|淞辖粼万方数据100 中国烟草学报Acta Tabacaria Sinica 2016 V0122 No3过表达Lcy-b基因对旺长期类胡萝卜素含量影响较大，而对成熟期影响较小，结合对烤后样类胡萝卜素降解产物的分析结果，可以推测，与未转基因对照相比，成熟期转基因烟草植株的类胡萝卜素降解更为充分，可能与转基因植株复杂的转录后时空调控有关。参考文献【1】 Giuliano G，Tavazza R，Diretto G，et a1Metabolic En
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36、lEffects of overexpression lycopene betacyclase gene on carotenoids metabolism and aromacompounds in tobaccoYANG Yongxia，ZHANG Jiawei，ZHANG Hongying，ZHANG Songtao，JIA Hongfang，CUI HongNational Tobacco Cultivation，Physiology&Biochemistry Research Centre；College of Tobacco Science，Henan AgriculturalUn
37、iversity，Zhengzhou，450002，ChinaAbstract：In order to reveal function of lycopene beta-cyclasecy-b)gene in the growth and development of tobacco plants，especially itsinfluence on aroma substance metabolismfull1ength cDNA sequence of Lcyb was cloned from tobacco variety K326 homology cloningstrategy an
38、d effects of overexpression of lycopene betacyclase gene on carotenoid components and aroma compounds were determined byagrobacterium-mediated transformationSequences analysis showed that tobacco Lcy-b contained 1 503-bp open reading frame(ORF)andcoded 500 amino acid residues，the calculated molecula
39、r mass was 5606612Da with theoreticalisoelectric point(pI)of 698Secondarystructure prediction results showed that they were mainly made up of alpha helix and random coilThe expression of Lcyb gene wassignificantly higher in some of the transgenic positive plants than that of K326 untransformed contr
40、01Correspondingly，the proportionof betacarotene，neoxanthin and violaxanthin increased and the proportion of lutein reducedAroma substance in the cured Ieaves alsodisplayed that the amounts of beta-carotene degradation products were significantly higher in transgenic positive plants than that of K326
41、untransformed control while the lutein degradation products were equivalent to or lower than that of K326 contr01These results showedthat Lcy-b could change the proportion of carotenoid components and affect the content of aroma components in cured samplesKeywords：tobacco；Lcyb gene；overexpression；carotenoids；aroma compoundsCitation：YANG Yongxia，ZHANG Jiawei，ZHANG Hongying，et a1Effects of overexpression lycopene beta-cyclase gene on carotenoidsmetabolism and aroma compounds in tobaccoJActa Tabacaria Sinica，2016，22(3)万方数据