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1、 苏太猪 FUT1 基因及其他候选基因的 遗传效应分析 研 究 生：曹晶晶 导 师：陈国宏 教 授 吴圣龙 教 授 中文摘要 本研究采用 PCR-RFLP 和 PCR-SSCP 方法研究了 576 头苏太猪试验群 FUT1基因 M307 位点多态性，并分析了其与部分经济性状的相关性。同时还对苏太猪Mx1、 DQB、 DQA 和 GH 基因共 5 个多态位点的多态性与部分生长性能进行了相关性分析，并分析了苏太猪 ESR 基因多态性与繁殖性状的相关性。旨在通过标记辅助选择加快苏太猪专门化品系配套的培 育进展，为苏太猪的进一步培育提供一定的理论依据。 具体结果如下： （ 1） FUT1 基因 M30
2、7 位点 PCR 产物长度为 161bp，采用限制性内切酶 Hin6消化后共出现 3 种基因型， 分别为 AA、 AG 和 GG 基因型， 基因型频率分别为 0.235、0.609 和 0.156。 抗病基因 A 的基因频率为 0.540， 敏感基因 G 的基因频率为 0.460。经卡方适合性检验，发现该群体偏离了 Hardy-Weinberg 平衡状态。 （ 2）利用最小二乘拟合线性模型，对 FUT1 基因 M307 位点不同基因型与苏太猪部分早期生长性状、体尺性状和胴体性状进行显著性检验，结果显示： AA 型个体和 AG 型个体 30 日龄断奶重均显著高于 GG 基因型个体（ P0.05）
3、 . As for the other three gene locus, the pigs with genotype AC, DE and DD were separately significantly higher than those with genotype AA, DD and CC （ PABBB. In first parity, the Number Born Alive（ NBA） and Birth Litter Weight（ BLW） had significant difference between AA and AB genotype as well as
4、between AA and BB genotype（ P 0. 05）。 4.6 Mx1 基因 Mx（ myxo-virus resistance）基因，即抗粘液病毒基因，是由 Lindenmann 等（ 1963）88在研究 A2G 小鼠对流感病毒具有天然抵抗力现象时，发现这种特性是从小鼠 16 号染色体上单一显性等位基因遗传获得的，由于能抵抗粘液病毒而得以命名。目前己在酵母以及脊椎动物包括哺 乳动物、禽类、蛙和鱼的多种类型细胞中都发现有 Mx 蛋白的表达，主要对 RNA 病毒敏感，包括弹状病毒、副粘病毒、正粘病毒89-91。体内外研究表明， Mx 基因在机体细胞受型干扰素或双链 RNA的
5、诱导以及病毒感染的情况下才被激活，转录、表达 Mx 蛋白，以抵抗病毒对细胞的感染，抵抗机制主要表现在其 GTP 酶活性对病毒核衣壳的水解作用，进而抑制病毒复制92。 目前研究发现猪的两种 Mx 蛋白，即 Mxl 和 Mx2， Muller 等（ 1992）90用小鼠 Mx1 的全长 cDNA 作为探针得到了编码 76kD 的猪 Mx1 蛋白的全长 cDNA。猪28 Mx1 基因己被定位于 13 号染色体上，与干扰素受体 1 基因（ interferon receptor 1, IFNARI）紧密连锁。猪 Mx1 基因 mRNA 长 2528bp，包含 15 个外显子93，包括一个 663 个氨
6、基酸开放阅读框。 Horisberger（ 1992）94对猪 Mx1 基因与疾病的相关性进行了研究，认为诱导猪细胞的 Mx 蛋白可以抑制流感病毒、水疱性口炎病毒（ VSV）和门戈病毒的生长。 Zhang 等（ 1999）95发现猪繁殖与呼吸综合症病毒的感染能诱导 Mxl 基因的转录以及 Mxl 蛋白的表达。 Atsushi 等（ 2002）96对两个猪肾细胞系 PK(15)和 LLC-PK1 细胞中的 Mx 基因 cDNA 序列进行了测定，发现在编码区存在氨基酸碱基的改变。经分析，认为猪 Mx1 基因的氨基酸替换可能会影响猪对 VSV 或者其他病毒的抵抗能力。 Takeya 等97分离并克隆
7、了猪 Mx1 基因第 14 外显子的序列，同时对其在 7 个不同猪种中的多态性进行了研究，结果发现了 3 种不同形式的多态。 Morozumi 等（ 2001）98报道了在猪 Mxl 基因第 14 外显子发现 2 个新的多态性位点，在不同品种中等位基因频率呈现很大差别。李晓丽（ 2005）99对 Mx1 基因第 6 内含子 SnaB-RFLP 基因型与胴体性状和肉质性状方面的关系分别进行了分析，结果认为在 SnaB-RFLP 分析中， B 等位基因可以提高眼肌宽， BB 基因型个体眼肌宽比 AA 基因型高 0.3134cm，且达到显著水平。SnaB酶切位点的不同基因型与背最长肌色值、股二头肌色
8、值、背最长肌大理石纹、股二头肌大理石差异显著，并均以显性作用方式为主；同时，分析 Mx1 基因第 9 内含子 Msp-RFLP 基因型与胴体性状的关系后，发现 Msp-RFLP 基因型不同时，骨率和臀部膘厚差异显著，主要表现在 AB 基因型和 BB 基因型个体间，B 等位基因在降低背膘厚的同时，提高了骨率。鞠慧萍（ 2007）100对 Mx1 基因第14 外显子 Hin6-RFLP 基因型与繁殖性能进行了分析，结果发现，在初产中，苏太猪 Mx1 基因各基因型间总产仔数、产活仔数和初生窝重均不存在显著差异， BC基因型间断奶仔猪数显著高于 BB 基因型（ P100kb）且无降解，则在加样孔附近呈
9、现一致密亮 带，若有部分降解，则呈现连续分布状态，若严重降解则看不到大片段的 DNA，只能在远离加样孔处见到弥散状 DNA。 具体操作过程为： 取 1TBE 25mL 加 0.25g 琼脂糖， 制成 1%的琼脂糖凝胶 （含Goldview 染料） 。取 5L 待检测 DNA 和 1L 6上样缓冲液，吹打均匀后用微量移液器将样品混合液加样于琼脂糖凝胶点样孔内，留一点样孔加 2LMarker 作为参照。当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离 DNA 片段的距离时，关闭电源。紫外灯下观察电泳结果、拍照并记录观察结果。 39 2.2 PCR 扩增 影响 PCR 反应的因素较多，主要有：退火温度、镁离子浓
10、度、引物浓度、循环次数、时间以及模板浓度、聚合酶量等 。其中，最主要的是退火温度和镁离子浓度，并在保证扩增效率的前提下尽量降低 PCR 反应体系中其它成分的用量。因此要对 PCR 进行优化。 PCR 的优化方法：在反应条件的基础上，维 持其它不变，只优化其中一个条件，将该参数设立一个梯度，逐一确定获 得最佳扩增效果的参数点，最后确定最优化的参数组合。例如，在确定退火温度时，先根据引物序列中的（ G+C）含量初步确定退火温度的大致范围，先在宽松 的低退火温度和长循环时间条件下，设二个水平对退火温度（每隔梯度）和镁离子浓度（每隔 0.5mM 梯度）进行正交设计和 PCR 反应，用 1%琼脂糖凝胶电
11、泳检测产物的扩增效率，待上述两个条件初步确定后，然后再适当调整其它反应条件，以达到最优的 PCR 反应条件组合。 对 6 对引物的 PCR 反应体系进行优化，建立的最优反应体系如表 2-1。 表 2-1 FUT1、 Mx1、 DQA、 DQB、 GH、 ESR 基因目的片段 PCR 反应体系 Table 2-1 PCR condition used for the FUT1、 Mx1、 DQA、 DQB、 GH、 ESR genes 反应体系 Reaction system FUT1 / Mx1/ESR DQA/DQB/GH 10Buffer 1.5 2.0 dNTPs 混合物（各 2.5mM
12、） 1 1.5 引物 1 和引物 2（ 10mol/L） 1.2 1.0 模板 DNA（ 100ng/L） 1.2 1.2 Taq 酶（ 5U/L） 0.15 0.2 双蒸灭菌水 8.75 13.3 总体积 15 20.0 引物序列及 PCR 反应条件见表 2-2。 40 表 2-2 FUT1、 Mx1、 DQA、 DQB、 GH、 ESR 基因的引物、扩增片段长度及 PCR 反应条件 Table 2-2 Primer, amplified length and PCR condition for FUT1、 Mx1、 DQA、 DQB、 GH、 ESR genes 基因 Gene 引物序列
13、Primer sequences 长度 Length 位置 location PCR 反应条件 PCR condition FUT1 (M307) up： 5-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3 lo： 5-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3 161bp 开放阅读框307bp 处 A Mx1 up： 5-TGAAGGAGCGGCTGATGC-3 lo： 5-GGCGGGGCTCATTCAAGT-3 290bp 第 14 外显子 A DQA up： 5-CTCCTCACCCCATCCCACTTA-3 lo： 5-AGCCTCCTCCCACTTTCCTTC-3 310bp 第
14、4外显子和部分的第 3和4 内含子 B DQB up： 5-CGGAATTCCCCGCAGAGGATTTCGTGTACC-3lo： 5-CCGTCGTGCCTTCCTCTAT-3 273bp 第 2 外显子 B GH up： 5-TTATCCATTAGCACATGCCTGCCA-3 lo： 5-CTGGGGAGCTTACAACATCCTT-3 605bp 第 2 外显子 C ESR up： 5-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3 lo： 5-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3 120bp 第 5 外显子 D PCR 扩增程序如下： A、 95 预变性
15、（ Predenature） 5 min， 94变性（ Denature） 1 min， 60.5 退火（ Anneal） 1min， 72 延伸（ Extension） 1 min， 30 个循环，最后 72 延伸 10min，4 保存。 B、 95 预变性 10 min， 94 变性 45s，适当的退火温度 60 复性 45s， 72 延伸 45s， 35 个循环，最后 72 延伸 10min， 4 保存。 C、 95 预变性 10 min， 94 变性 45s，适当的退火温度 59 复性 45s， 72 延伸 45s， 35 个循环，最后 72 延伸 8 min， 4 保存。 D、 95
16、 预变性 4 min， 94 变性 1min，适当的退火温度 55 复性 30s， 72 延伸 30s， 35 个循环，最后 72 延伸 7min， 4 保存。 41 2.3 PCR 扩增产物的检测及 PCR-RFLP 分析 (1) PCR 扩增产物检测及酶切反应体系：用 1.5 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。对FUT1 与 Mx1、 DQB、 GH、 ESR 基因的 PCR 产物， 分别进行限制性内切酶 Hin6、Hae与 Rsa、 Apa、 Pvu酶切， 5 种内切酶的酶切反应均是在 37水浴中温育 3 h，酶切反应体系见表 2-3。 表 2-3 FUT1 与 Mx1、 DQB、 GH、 E
17、SR 基因 PCR 产物的酶切反应体系（单位： L） Table2-3 Endonuclease reaction resolution of PCR products of FUT1 and Mx1、 DQB、 GH、 ESR genes Endonuclease Volume of EndonucleaseBuffers of Endonuclease Product of PCR ddH20 Total Vo l n me Hin6、 Hae、Rsa 0.3 1 5 3.7 10 Apa 0.2 2 10 2.8 15 Pvu 0.2 0.5 2.5 1.8 5 (2) 10 % 聚丙烯
18、酰胺凝胶的制备：在一干净的小烧杯中加入以下成分： 30 % PAGE 10 mL 1 TBE 20 mL 10 % AP 200 L TEMED 30 L Total 30 mL 混匀后，迅速灌胶，小心插入梳子，室温下聚合 0.5-1 h，使胶充分凝固。取下梳子，用 1TBE 冲洗点样孔， 100 V 预电泳 10 min。 (3) 电泳：取 10L 酶切产物和 1L 6上样缓冲液，吹打均匀并用微量移液器加样于点样孔中，并点上 Marker；插上电源， 150V 电压，电泳 5h。 (4) 银染：取固定液置于平面皿中，将凝胶轻轻放入，在摇床上轻摇 20min 左右。去掉固定液用双蒸水冲洗 3
19、次 (每次 2min)。将银染液倒入，轻摇 10min， （将银染工作液倒入一棕色瓶中， 可重复使用 2-3 次） ， 用双蒸水冲洗胶 1-2 遍。在银染的同时配置显色液，现配现用。将胶放 入显色液中显色并于摇床上轻摇，直至条带清晰出现，倒掉显色液，立即用 大量蒸馏水冲洗。用封口袋封好，在凝胶成像系统中拍照并保存。 42 2.4 DQA 基因扩增产物的 PCR-SSCP 分析 10聚丙烯酰胺凝胶的制备同上。取 10L PCR 产物与 8L 的上样缓冲液混合， 98 变性 10 min，迅速插入碎冰中冷却 5 min，上样，先 250 V 电泳 10min，便于单链 DNA 初步分离，然后 90
20、-120V 恒压电泳 11-14h。银染过程同上。 2.5 PCR 产物的直接测序 根据 PCR-SSCP 分析结果，对于具有多态的位点选取不同的纯合子进行序列测定。 PCR 产物经电泳鉴定后，用胶回收试剂盒（ BBI， Canada）回收目标片段、纯化后，交由上海生工生物工程技术服务有限公司 ABI PRISM 377DNA 自动测序仪完成序列测定。 3 相关软件及统计方法 3.1 相关软件 引物设计软件： Premier Primer 5.0, Oligo 6.0, Primer 3.0 在线引物设计软件 序列分析软件： DNAStar, BLASTn, AlignIR2.0 常规统计软件
21、： SAS8.02（ Statistical Analysis System） SPSS 11.5（ Statistical package for the social science） 3.2 资料的统计与分析 3.2.1 基因频率和基因型频率的计算 (1) 基因频率（ gene frequency） ：指特定位点上一个等位基因数目占该位点上全部等位基因总数的比率。 Pi 2(ii)+(ij1)+(ij2)+(ijn)/2N Pi：第 i 个等位基因的频率 i：纯合复等位基因 j1， j2jn：与 i 共显性的第 1 到第 n 个等位基因 (2) 基因型频率（ genotype frequ
22、ency） ：指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。由于 PCR-RFLP 和 PCR-SSCP 方法的检测结果为共显性等位基因，此表43 型频率即为基因型频率。 基因型频率基因型个体数 /测定群体总数 3.2.2 Hardy-Weinberg 平衡检测 Hardy-Weinberg 平衡是指一个无穷大或足够大规模的、随机交配的孟德尔群体，如果没有突变、迁移、自然或人工选 择等影响，某一位点上各种基因型频率在世代交替过程中保持稳定不变。这种稳定状态称为 Hardy-Weinberg 平衡。 平衡状态的判定用卡方适合性检验进行。 2=2()niiiiOEE(df2) 当 df 1 和小样本
23、尤其是理论次数小于 5 的情况下，必须进行矫正，采用英国叶斯（ F.Yates）提出的矫正公式，矫正公式如下： 2=211()2iiniiOEE=(df 1) Ei：理论值， Oi：实际观察值， n 为等位基因数 3.2.3 统计分析模型 在数据处理中，根据影响生长发育的 因素建立如下线性固定模型，运用SPSS11.5 软件的广义线性模型（ General Linear Model ,GLM）对各性状值与基因型的关系进行最小二乘分析： 其中： yijkm为个体表型记录； 为总体均值， Agek为年龄效应； Markern为标记基因型效应； eijkm为随机误差。由于本实验猪群年龄差异不大，同属
24、一批后备种猪，所以模型中没有考虑年龄效应。 对于繁殖性状，分别计算初产和经产的总产仔数（ TNB） 、产活仔数（ NBA） 、初生窝重（ BWL） 、断奶成活数（ NW）及断奶窝重（ WWL）。数据采用 SAS 8.02 统计软件分析。所构建的统计模型包括固定效应：母猪效应、 ESR基因型；随机效应：随机残差效应。 44 Y =均数 +母猪效应 + ESR 基因型 +年季效应 +残差 对于胴体性状，对苏太猪不同基因型个体背膘厚的最小二乘均值进行估计和显著性检验。统计分析模型： y = + G + bW+ e 其中 y 为背膘厚值， 为总体均值， G 为基因型效应， W 为检测时的体重，作为协变
25、量， b为体重的回归系数， e为残差效应。由于基因型效应分析的个体来自同一饲养小区，均为基础试验猪，且检测的体重都为 60Kg，因此模型中不包含场效应和品种效应，分析效应时也不考虑体重效应。 3.2.4 各性能资料的整理 将苏太猪试验群的经济性状资料按家系分上述 三个性状整理，使样本中的胎次来源尽量一致。繁殖性状的记录包括总产仔数（ TNB） 、产活仔数（ NBA） 、初生窝重（ BWL） 、断奶成活数（ NW）及断奶窝重（ WWL） ，生长发育性状的记录包括初生重、 30日龄断奶重、体长、体高和后 躯长，胴体性状为背膘厚的记录。尽可能地做到不遗漏，以保证试验的可靠和真实性。 其中产仔性状的样
26、本含量指已测基因型（ ESR 基因型）的全部繁育母猪头数（选育前的 79 头母猪） ，生长性状较全面的样本含量指已测基因型（ GH 基因型）的繁育母猪的仔猪头数（ 73 头） ；早期生长性状的样本含量指己测基因型（ FUT1、Mx1、 DQB 和 DQA 基因型）的后备猪头数（选育中的第 4 个世代，共 97 头） ；体尺性状和胴体性状的样本含量指已测基因型（ FUT1 基因型）的后备猪头数（选育中的第 4 个世代，共 72 头） 。 45 第三章 基因多态性检测结果 1 猪基因组的 DNA 提取结果 图 3-1 基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳结果 Fig.3-1 Agarose elect
27、rophoresis of genomic DNA 猪基因组 DNA 经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，检测样本几乎没有拖尾现象，说明提取的 DNA 质量较好（见图 3-1） 。 2 FUT1 基因 PCR-RFLP 多态性检测结果 2.1 FUT1 基因 PCR 扩增检测结果 将扩增得到的 PCR 产物，用 2 %的琼脂糖电泳检测，结果如图 3-2，从图上可以看出扩增特异性良好，无引物带和其它杂带。 图 3-2 FUT1 基因 PCR 扩增检测结果 Fig 3-2 Detection of PCR product of FUT1 gene, M: pUC19 DNA/Msp（ Hpa）标准分
28、子量 2.2 FUT1 基因 PCR-RFLP 检测结果 本实验的 FUT1 基因扩增片段长度为 161bp， 在其开放阅读框的第 307 bp 处存在一个点突变。 PCR 产物经限制性内切酶 Hin6酶切后可产生多态图谱。正常未突变的情况下，该片段能够被限制性内切酶 Hin6完全消化，产生 GG 基因型46 （ 117bp/44bp） ； 当发生了 G A突变后， 由于该等位基因上酶切位点的丢失， Hin6不能对其消化，产生 AA 基因型（ 161bp） ；当 2 个等位基因同时存在时产生 AG 基因型（ 161bp/117bp/44bp） 。苏太猪 FUT1 基因 M307 的 PCR-R
29、FLP 电泳图谱见图3-3。 图 3-3 猪 FUT1 基因 M307 扩增产物 PCR-RFLP 电泳图 Fig.3-3 PCR-RFLP（ Hin6） patterns of M307of FUT1 gene GG： 1、 5、 6； AA： 2； AG： 3、 4、 7 M: pBR322 marker/BsuRI（ HaeIII） 3 Mx1 基因 PCR-RFLP 多态性检测结果 3.1 Mx1 基因 PCR 扩增检测结果 猪 Mx1 基因第 14 外显子 PCR 产物经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，可看到一条特异性较高的片段，片段长度在 290bp 左右，与预期的扩增片段大小相一
30、致，结果见图 3-4。 图 3-4 Mx1 基因 PCR扩增产物的电泳结果 Fig.3-4 Electrophoresis of the PCR product of Mx1 gene M： DL2000 Marker 3.2 Mx1 基因第 14 外显子 Hin6酶切消化结果 本实验利用 PCR-RFLP 方法对 Mx1 基因第 14 外显子进行多态检测。结果发现苏太猪群体 Mx1基因第 14外显子的多态性丰富， 出现了 5种基因型： 255bp/35bp、47 290bp、 290bp/255bp/35bp、 279bp/255bp/35bp、 290bp/279bp/11bp，分别命名为
31、 AA、BB、 AB、 AC 和 BC。由 A、 B 和 C 复等位基因控制。扩增片段存在一个 Hin6酶切位点，酶切后产生 AA 基因型（ 35 bp/255 bp） ，其中第 36 bp 处为多态性酶切位点，当此酶切位点因发生 G/T 突变时而消失时，扩增片段不能被消化产生基因型为 BB（ 290 bp） ，同时 Mx1 基因在该扩增片段中存在一个包含有 Hin6酶切位点的 11 bp 碱基缺失， 从而使得整个扩增片段比预期的 290 bp 短， 且不能被 Hin6消化，形成基因型 CC。本实验结果未检测到 CC 型。因此，该位点变况还需进一步研究。图 3-5 为苏太猪的 PCR-RFLP
32、 基因分型图。 图 3-5 Mx1 基因第 14 外显子 Hin6酶切结果 Fig.3-5 Image of digested PCR product of exon14 of Mx1 gene with Hin6 AA： 2、 3； BB： 4； AB： 5； AC： 1； BC： 6 M: pBR322 marker/BsuRI（ HaeIII） 4 DQB 基因 PCR-RFLP 多态性检测结果 4.1 DQB 基因 PCR 扩增检测结果 经 PCR 扩增后， SLA-DQB 基因外显子 2 的 PCR 产物经电泳检测得到一条273bp 的特异性条带。 PCR 产物电泳图谱见图 3-6。
33、 图 3-6 DQB基因 PCR扩增产物的电泳结果 Fig.3-6 Electrophoresis of the PCR product of DQB gene M: pUC19 DNA/Msp (Hpa )标准分子量 48 4.2 DQB 基因 Rsa及 Hae的 PCR-RFLP 分析结果 4.2.1 DQB 基因 Rsa的 PCR-RFLP分析结果 DQB 基因外显子 2 的 PCR 产物经过限制性内切酶 Rsa酶切后，分出了不同的RFLP 带型（图 3-7） ，共分出 5 种基因型： AA:27bp/246bp、 BB:27bp/84bp/30bp/133bp、 CC:114bp/13
34、3bp AB:27bp/84bp/30bp/133bp/246bp、 AC: 27bp/114bp/133bp/246bp 图 3-7 SLA-DQB 基因外显子 2 Rsa酶切结果 AA： 3、 6、 7； BB： 9； CC： 1； AB： 4、 5、 8； AC： 2 Fig.3-7 Band patterns of the exon 2 of SLA-DQB gene digested with Rsa M: pBR322 marker/BsuRI(HaeIII) 4.2.2 DQB 基因 Hae的 PCR-RFLP 分析结果 DQB 基因外显子 2 的 PCR 产物经过限制性内切酶
35、Hae 酶切后（图 3-8） ，共分出 3 种基因型： DD:84bp/83bp/23bp/29bp/54bp、 EE:167bp/4bp/112bp DE: 167bp/84bp/83bp/4bp/23bp/29bp/54bp/112bp 图 3-8 SLA-DQB 基因外显子 2 Hae酶切结果 DD： 4、 5； EE： 1、 6、 8； DE ： 2、 3、 7 Fig.3-8 Band patterns of the exon 2 of SLA-DQB gene digested with Hae M. pBR322 marker/BsuRI（ HaeIII） 49 5 DQA 基因
36、 PCR-SSCP 多态性检测结果 5.1 DQA 基因 PCR 扩增检测结果 苏太猪 SLA-DQA 基因扩增产物经 1.5的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图 3-9，片段大小为 310bp，包含了完整的第 4 外显子和部分的第 3 和 4 内含子。 图 3-9 DQA 基因 PCR扩增产物的电泳结果 Fig.3-9 Electrophoresis of the PCR product of DQA gene M: pUC19 DNA/Msp（ Hpa）标准分子量 5.2 DQA 基因 PCR-SSCP 检测结果 本试验所扩增的 PCR 产物结果较好， 片段长度与所设计的扩增片段大小一致，无非特异
37、性条带，可进行 SSCP 分析。对扩增产物进行 SSCP 检测发现有 3 种基因型，根据带型可定义为 CC、 CD、 DD 3 种基因型。如图 3-10 所示。 图 3-10 SLA-DQA 基因扩增片段的 SSCP分析结果 CC： 2、 3、 4； DD： 6； CD： 1、 5 Fig.3-10 the SSCP analysis about PCR amplification of the SLA-DQA gene 5.3 序列分析结果 取 CC 和 DD 两种基因型的 PCR产物片段进行纯化测序。结果 DD 型与GenBank（ AY303988）中的序列一致，定义为野生型。 CC 型
38、与 DD 型相比在处于第 4 外显子的 5233 处发生碱基 G A的突变，定义为突变型。将突变型的核苷酸50 序列演绎成氨基酸序列后，发现突变的结 果导致相应的氨基酸由丙氨酸代替了苏氨酸。测序峰图见图 3-11。 CC型 DD型 图 3-11 CC 型和 DD 型 5233 处突变测序图 Fig.3-11 The mutations in 5233 nucleotide between CC and DD genotypes 6 GH 基因和 ESR 基因 PCR-RFLP 检测结果 苏太猪 GH 基因的 -119 +486 bp 片段经 PCR 扩增， Apa酶切后 , 产生等位基因 C（
39、 449 +101+55bp）和等位基因 D（ 316+133 +101+55bp） ； 3 种基因型， 即CD 型（ 449+316+133+101+55bp ） 、 CC 型（ 449+101+55bp ）和 DD （ 316+133 +101+55bp） 。如图 3-12 所示。 图 3-12 猪生长激素基因 ApaI 酶切图 CC： 2； DD： 4、 5； CD： 1、 3 Fig.3-12The PCR-RFLP pattern in the sequence of pGH gene with ApaI digestion M： DL2000 Marker 51 ESR 基因 PC
40、R-RFLP 结果如图 3-13 所示， 从图中可看出经限制性内切酶 Pvu酶切后出现多态性，根据条带的数目和位置，确定有 3 种基因型，分别为 AA 基因型 (120 bp/ 120 bp) 、 AB 基因型 (120 bp/ 65 bp + 55bp) 、 BB 基因型 (65 bp + 55 bp/ 65bp + 55 bp) 。 图 3-13 ESR 基因 PCR-Pvu-RFLP 的电泳结果 AA： 10； BB： 5、 9； AB： 1、 2、 3、 4、 6、 7、 8 Fig.3-13 The PCR-RFLP pattern in the sequence of ESR ge
41、ne with Pvu-digestion 52 第四章 基因多态与性状关联分析 1 苏太猪 FUT1 基因 M307 位点的基因型分布及基因频率 表 4-1 苏太猪 FUT1基因的基因频率和基因型频率分布Table 4-1 The frequencies of genotype and allele of FUT1 gene in Sutai pigs FUT1 基因型 FUT1 Genotype FUT1 等位基因 FUT1 Allele AA（ 135） AG（ 351） GG（ 90） A G 频率 Frequency 0.235 0.609 0.156 0.540 0.460 注：括
42、号内数字为该基因型样本含量 Note: The figures in the brackets are the number of the sample 对苏太猪 FUT1 基因的 PCR-RFLP 基因型和基因频率进行统计分析表明，苏太猪该基因第 307 位碱基处存在 A 和 G 等位基因，即存在多态性，只是基因频率分布不同。 AA 基因型频率为 0.235， AG 基因型频率为 0.609， GG 基因型频率为0.156， 等位基因 A 为优势等位基因。 2适合性检验结果表明， 苏太猪偏离了 Hardy -Weinberg 平衡状态（ P0.05） ， 基因型对苏太猪初生重影响依次为 BC
43、ABACBBAA，对 35 日龄体重影响依次为 BCBBABACAA。对于 DQB 基因的 Rsa酶切位点，基因型为 AC 的个体初生重极显著高于 AA 型个体（ PBBABCCAA， 不同基因型对苏太猪 35 日龄断奶重影响无显著性差异（ P0.05） ，对 35 日龄体重影响依次为 CCAABBACAB；对 DQB 基因的 Hae酶切位点， 基因型为 DE 的个体初生重极显著高于 DD 型个体（ PEEDD， 三种基因型对 35 日龄体重的影响差异不明显；对于 DQA 基因，基因型为 CD 的个体初生重极显著高于 CC 型个体（ PDDCC，三种基因型对 35 日龄体重的影响依次为 DDC
44、CCD，无明显差异。 表 4-6 苏太猪 4 个基因位点不同基因型与生长性能的关系 Table 4-6 Association between different genotypes in four gene locus and growth performance 位点 loci 基因型 Genotypes 初生重 birth weight 35 日龄重 35-day body weight AA（ 37） AB（ 25） AC（ 25） BB（ 5） Mx1 BC（ 5） 1.164 0.046 1.262 0.058 1.214 0.058 1.198 0.130 1.338 0.130
45、 7.384 0.255 7.803 0.310 7.552 0.310 8.224 0.693 8.520 0.693 AA（ 49） AB（ 21） AC（ 9） BB（ 9） DQB- Rsa CC（ 9） 1.1320.040b1.2430.061ab1.4210.094a1.2590.094ab1.2200.094ab7.771 0.224 7.290 0.342 7.562 0.523 7.612 0.523 7.823 0.523 DD（ 49） DE（ 30） DQB-Hae EE（ 18） 1.1320.040b1.2960.051a1.2390.066ab7.7710.22
46、2 7.3720.284 7.7180.366 CC（ 52） CD（ 30） DQA DD（ 15） 1.1330.039b1.2960.051a1.2550.073ab7.6340.214 7.3730.281 8.1800.398 注：字母相同为差异不显著，字母不同差异显著 (P0.05） ，基因型对苏太猪初生重影响依次为 CCDDCD。 30日龄体重、 4月龄体重和 6月龄体重影响依次为 CCCDDD。 3.4 ESR 基因多态性与苏太猪繁殖性状的关系 苏太猪 ESR 基因 Pvu突变位点不同基因型对其繁殖性能的影响见表 4-8。 57 表 4-8 不同基因型对苏太猪繁殖性能的影响 T
47、able 4-8 Effects of different genotypes on reproduction traits of Sutai pigs 初产（头胎） first parity 经产（二胎以上） later parity AA(7) AB(45) BB(27) AA(7) AB(45) BB(27) 总产仔数 (头 ) （ TNB） 11.710.880 10.220.347 10.040.44815.1671.109A12.4740.441B11.9550.579B产活仔数 (头 ) （ NBA） 10.910.807a9.200.318b9.320.411b12.8330.98111.2110.390 10.7270.512初生窝重 (Kg)（ BLW） 12.7570.946a10.8170.373b10.6210.482b13.0331.12613.0090.447 12.2590.588断奶成活数(头 )（ NW） 9.000.833 8.310.329 8.300.424 12.0380.984a10.0790.391b9.955 0.447b断奶窝重 (Kg)（ WWL） 63.575.814 61.42 2.29362.5932.96080.5005.554a71.005