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1、1 / 11 标 准 操 作 程 序STANDARD OPERATING PROCEDURE 题目：药典分析方法验证标准操作规程。2、范围：药典分析方法验证(USP。3、责任者：质量研究部、QC 化验员。4、程序：标准来源 USP37 药典分析方法验证用于评价药物质量的检验方法应符合一定要求。根据联邦食品、药品、化妆品第501 条的规定，在美国药典的正文检验方法和规定为法定标准。按照现行药品生产管理规范有关条文21 CFR 211.194(a要求，用于评价药品是否符合既定标准规定的分析方法应具有一定准确性和可靠性。按照该要求 21 CFR 211.194(a(2，USP和 NF 分析方法使用者
2、不必验证方法的准确性和可靠性，但要确认在实际使用条件下的适用性。考虑到USP和 NF 标准法定地位这一基本情况，所以，药典品种新方法或修订方法得建议，应由充分实验室数据支持，以说明方法有效。本指导通则内容尽可能与三方国际协调会ICH）关于在欧盟、日本和美国注册申报资料要求中与分析方法部分有关的分析方法验证和方法学文本一致。药典申报新的或修订的分析方法得药典申报，应报送充分的资料，以便美国药典委员会专家理事会及其专家委员会对建议的方法进行审评。多数情况下，审评内容一般为评价叙述的分析方法是否清晰完整，需要建立该方法的结论，以及方法验证文本。方法类型不同，申报要求可能不同，一般包括下列内容：理由
3、写明需要本方法的理由、用途以及与其他方法比较的优点。修订的方法应写明现行药典方法的局限性以及建议方法得优点。建议的分析方法应完整详细地写明建议的分析方法，以便他人依法操作。文字应包括全部重要的操作参数和有关事项以及明确的实验结果计算公式。数据元素本部分要求提供详细、完整的分析方法验证文件，文件应包括实验数据及各适用的分析方法运行特性计算结果。运行特性在下文中叙述。验证分析方法验证是通过实验室研究证明该分析方法的运行特性符合其分析应用要求的过程。表1 中列出了本文分析方法验证需考虑的典型分析运行特性。由于对术语有不同的理解和用法，本通则以下部分包括各运行特性的定义以及衡量特性的方法描述。定义与“
4、 测定结果 ” 有关。分析方法的叙述应写清该方法精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 11 页3 / 11 得测定结果是什么。 ISO5725-1 和 3534-1 指出， “ 测定结果是用特定测定方法得到的特性值。分析方法应规定进行一次还是数次单独测定，作为测定结果报告的平均值，或其他适宜函数如，中位数或标准偏差）。可能要求做标准校正，如气体体积校正到标准温度和压力时的体积。所以测定结果可以是数个观察值的计算结果。简单实验时，测定结果就是观察值本身” 。测定结果是用于与标准规定限度比较的最终报告值，但偶有例外。物理性质测定方
5、法验证可能包括化学计量模型。方法验证中用到的典型分析特性可用于基于化学计量模型的方法。表 1 分析方法验证用典型分析特性准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性用代表性样品进行分析方法验证时，应考虑工艺条件和物料差异的影响。下列情况下，药典分析方法应进行再验证：报送USP 的修订分析方法；或将已有通用方法用于新产品或新物料制成的产品见下文方法所需数据元素部分）。国际协调会 ICH）有关文本建议下列情况下需在验证：原料药合成工艺改变；药物制剂组方改变；分析方法改变。通则提供适于大多数药典分析方法得验证要求信息。药典分析方法验证可按照表1 中列出的部分或全部分析特性，以及表2 中分析方法分类进
6、行。有的药典分析方法验证要求超出通则的特性。则可按各有关方法通则规定的分析验证特性或特殊验证要求进行。分析运行特性准确度定义分析方法得准确度系指该方法所得测试结果与真值的接近程度。分析方法的准确度应在一定范围内测定。关于术语：通则 和 ICH Q2 中准确度定义为不偏离程度和 国 际 标 准 组 织 the International Organization for Standardization(ISO的文件中， “ 准确度 ” 有不同的意思。 ISO 准确度的定义把不偏离程度 真实度）与精密度的概念合在一起。测定对于原料药含量测定，用分析方法测定已知纯度的供试品如对照品），或用被验证方法
7、测定结果与其他已知准确度的方法测定结果进行比较，测得准确度。对于制剂中药物的含量测定，用分析方法测定制剂成分混合物中按照方法范围加入的已知量被测物，测得准确度。如不能获得全部制剂成分，可向制剂中加入已知量被测物加样法）进行测定，或用被验证方法测定结果与其他已知准确度的方法测定结果进行比较。对于杂质定量分析，原料药或制剂中加入已知量杂质，测得准确度。如不可能得到某些杂质或降解产物，可以将测定结果与另一方法测得结果进行比对。如没有其他方法，可比较杂质和被测物质的响应值，即等量杂质和被测物响应值比值 相对响应因子），如果已知该比值，可用于计算杂质含量。准确度为样品中被测物已知加入量含量测定的百分回收
8、率，或平均值与可接受真值的偏差，同时报告置信区间。ICH 有关文件建议在规定范围至少3 个浓度至少测定9 次的结果确定准确度即 3个浓度，每个浓度重复测定3次）。准确度的确定可以用不同方法，包括在含量测定范围内测定被测物回收率百分回收率），或测定估计浓度与真实浓度的线性关系。建议统计判断标准为斜率的置信区间应在约1.0区间内，或斜率应接近1.0。在验证文件中均应规定区间或接近程度的定义。判断标准取决于含量测定方法和变异以及结果。不建议在斜率为 1.0时用零假设检验没有统计意义地确定判断标准。物理性质测定方法的准确度可通过标准物质分析确定，或根据具体情况对上述方法得适用性进行具体分析来确定。精密
9、度定义分析方法的精密度系指均匀样品多次取样用该分析方法测定各结果的一致程度。分析方法的精密度常用一系列测定结果的标准偏差或相对标准偏差变异系数）表示。精密度衡量在正常操作条件下分析方法的重现性和重复性。重复性系指不同实验室用该分析方法测定，如协同研究。中间精密度也称耐用性）为实验室内差异，即在同一实验室在不同日期，或用不同分析人员，或用不同设备用该分析方法进行测定。重复性系指在一个实验室由一个分精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 11 页5 / 11 析人员用相同设备在短时间内用该分析方法进行测定。测定分析方法的精密度是对足
10、够份数的一个均匀样品进行测定，以便计算标准偏差或相对标准偏差变异系数）统计有效的估计数。本测定为各份样品从样品制备得到最终结果进行的全部分析过程。ICH 有关文件建议在规定范围至少3 个浓度至少测定9 次的结果确定准确度即 3 个浓度，每个浓度重复测定3 次），或用 100%测试浓度至少 6 次测定结果。专属性定义ICH 定义专属性在杂质、降解产物以及辅料存在下分析方法能准确确定被测物质存在的能力。如果缺乏专属性，可用其他分析方法弥补。注：国际专业权威机构 IUPSC,AOAC-I ）采用 “ 选择性 ” 这个术语，对选择性极高的分析方法保留 “ 专属性” 这个术语 。对于下面讨论的分析方法，
11、以上定义具有以下含义：鉴别实验：鉴定被分析物特性纯度检查：采用的所有分析方法能给出被测物质中杂质的准确含量如有关物质检查、重金属限度检查、有机挥发性杂质检查）。含量测定：给出正确结果，样品中被分析物含量或效价的准确结果。测定定性分析 鉴别实验）方法。应能显示区分可能存在的结构十分相关的化合物的能力。用含有被分析物质的阳性反应与已知对照品对照）加上不含被测物质样品的阴性反应进行确证，并确证阳性反应不是与被分析物结构相似或十分相关的物质产生的。杂质分析方法，向原料药或制剂中加入适量杂质，应能显示这些杂质的测定结果具有一定准确度和精密度。含量测定分析方法，其专属性应能显示该分析方法不受杂质或辅料存在
12、的影响。实际做法可向原料药或制剂中加入适量杂质或辅料，确定测定结果不受这些外来物质的影响。如果杂质或降解产物得不到，可将含有杂质或降解产物的样品测定结果与用另一确证了的方法测定结果比较，以说明其专属性。应包括对贮存在相应苛刻条件下的样品测定比较。含量测定分析方法，应比较这些结果；色潜纯度检查应比较杂质的检出情况. ICH 有关文件说明，当使用色谱分析方法时，验证资料中应附代表性色谱精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 11 页6 / 11 图，以显示其选择性好坏，应标明每个色谱个峰。峰纯度检查如用二极管阵列或质谱法检测）可用于
13、显示被测定物色谱峰仅为一个成分。用波谱法的定性定量测定方法验证，应参考有关通法，如近红外光谱法、拉曼光谱法、 X 射线粉末衍射法等。检测限定义检测限是限度检查的特性。检测限系指在规定实验条件下样品中被分析物能被检出的最低量，不一定要求定量。因此，限度检查只要说明被分析物的量髙于或低于一定限度。检测限通常以样品中被分析物的浓度表示。测定非仪器分析方法，一般用已知浓度被分析物的样品进行分析，求得该被分析物能被可靠检出的最低浓度。仪器分析方法，可用与非仪器分析方法相同方法求得检测限。分析方法推荐作为药典方法时，不必要测定实际的检测限。实际上，用含高于和低于规定检测浓度的已知浓度被分析物样品求得的检测
14、限是非常低的。例如，要求检查浓度为 0.1%的杂质，应表明，用本法能可靠地检出该浓度的杂质。具有基线噪音的仪器分析方法，ICH 有关文件叙述了一个常用方法，即将含已知低浓度被分析物样品测得的信号与空白样品信号比较。可以确定可靠检出被分析物的最低浓度。一般可接受的信噪比为2：1 或 3：1。其他方法如按照标准曲线的斜率和响应值的标准偏差计算检测限的。无论用那种方法，必须用接近检测限或制备成检测限浓度的数个样品，对检测限进行最后验证。定量限定义定量限是样品基质中低浓度化合物定量测定的特性，如原料药中的杂质和最终药物制剂中的降解产物。定量限系指在规定实验条件下样品中被分析物能被测定的最低量，且具有可
15、接受的精密度和准确度。定量限通常以样品中被分析物的浓度表示 。测定非仪器分析方法，一般用已知浓度被分析物的样品进行分析，求得该被分析物能被测定且具有可接受准确度和精密度的最低浓度。仪器分析方法，可用与非仪器分析方法相同方法求得定量限。分析方法推荐作为药典方法时，不必要测定实际的定量限。实际上，用含高于和低于规定定量浓度的已知浓度被分析物样品求得的定量限是非常低的。例如，要求测定被分析物的浓度为每片0.lmg,应表明，用本法能可靠地定量测定该浓度的被分析物。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 11 页7 / 11 具有基线噪音
16、的仪器分析方法，ICH 有关文件叙述了一个常用方法，即将含已知低浓度被分析物样品测得的信号与空白样品信号比较。可以确定可靠测定被分析物的最低浓度。一般可接受的信噪比为10：1。其他方法如按照标准曲线的斜率和响应值的标准偏差计算定量限的。无论用那种方法，必须用接近定量限或制备成定量限浓度的数个样品，对定量限进行最后验证。线性和范围线性的定义分析方法的线性系指在一定范围内样品中被分析物测定结果与其浓度直接或经适当数学转换呈正比关系，所以，在本段中“ 线件” 就是浓度和测定结果关系的线性。有时，浓度和/或测定结果需经转换方能求得线性结果。(注：用转换方法时，回归分析用的权重因子可能会改变。常用的转换
17、如对数转换、平方根转换或倒数转换，或其他适宜的转换方法。如果无法得到线性关系，可用非线性模型。无论是线性还是非线性，目的是求得浓度与响应值的关系。范围的定义分析方法的范围系指用该方法测定得到具一定精密度、准确度和线性关系结果的被分析物高浓度和低浓度区间含这两个浓度）。范围常以用该分析方法测定结果相同的单位表示如百分浓度，百万分之几）。线性和范围的测定线性应在分析方法范围内确定。线性的确定应先用直观方法，用响应值作为被分析物浓度的函数作图进行判断。如有线性关系，再用统计方法处理 如用最小二乘法进行回归计算）。回归线有关的数据可作为线性程度的数学估计。应报送相关系数、y 截距、回归线的斜率以及残差
18、平方和。应确认用范围内和范围两端浓度被测物的样品测定结果是否具有可接受精密度、准确度和线性，来验证分析方法的范围。ICH 建议一般应至少用5 个浓度确定线性。 ICH 还建议下列应考虑的最小规定范围：原料药 或最终制剂）的含量测定：测试浓度的80%? 120%。杂质的测定：可接受限度的50%? 120%。含量均勻度测定：除证明剂型特性需要更宽或更适宜范围外。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页，共 11 页8 / 11 习用的线性定义，即线性的确定方法，或样品浓度与响应值之间数学关系的确定方法，不适用于粒度分析。粒度分析中，测定浓
19、度范围仪器-粒度相关）的规定应为，测定的粒度分布不受规定浓度范围内浓度变化的影响。浓度低于规定浓度范围时，由于信噪比差而带来误差，浓度超出规定浓度范围时，会由于多重散射而引入误差。耐用性定义分析方法的耐用性系指分析方法文件所列测定参数有小的并合理的变动时，测定结果不受影响的能力，说明正常使用该法的适用性。耐用性可在建立分析方法时确定。系统适用性如果测定结果易受分析条件的影响，则应适当控制分析条件，或在分析方法中写明注意事项。分析方法耐用性和重现性评价可用确定一系列系统适用性参数的方法，以保证应用时方法的有效性。典型变动有：分析溶液的稳定性、不同仪器和不同分析人员。液相色谱情况下，典型变动有：流
20、动相的pH 值、流动相的组成比例、不同批号的色谱柱或不同牌号的色谱柱、柱温和流速。气相色谱情况下，典型变动有：不同批号的色谱柱或不同牌号的色谱柱、温度和流速。系统适用性实验应把仪器、电子系统、分析操作、被分析样品作为整体考虑来进行评价。特定分析方法的系统适用性参数应按照被评价分析方法的类型确定。系统适用性参数对色谱法特别重要。向USP申报有关资料时，请参看通则色谱法 中系统适用性这一节的具体要求。验证所需数据元素药典测定从非常严格的分析测定到主观特性评价，有着不同的要求。考虑到这么大的变数，合理的做法是不同分析方法要求不同的验证方案。本通法仅包括要求验证数据的最常用测定法类别。这些类别如下：类
21、别用于原料药主成分或最终药物制剂有效成分包括防腐剂）含量测定的分析方法。这些分析方法包括定量测定和限度检查。类别用于原料药中的杂质或最终药物制剂中降解产物测定的分析方法。这些分析方法包括定量测定和限度检查。类别 测定性能特点的分析方法如溶出度，药物释放等）。类别 鉴别实验。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页，共 11 页9 / 11 每个类别需要不同分析资料。表2 为各类别一般所需的数据元素。表 2 验证所需数据元素分析运行特性类别 I 类别类别类别定量限度检查准确度要要* * 不要精密度要要不要要不要专属性要要要* 要检测限不
22、要不要要* 不要定量限不要要不要* 不要线性要要不要* 不要范围要要* * 不要* 根据特定分析方法的特性，可能需要。已有测定通用方法 ，当用于新产品或新原料检查时，应确认其适用性，如准确度。验证物理特性方法时，可用任一分析方法所需的相同运行特性，根据具体情况来具体评价运行特性的使用，以确认该分析方法是否适用于其既定目的。各验证参数可接受限度应与其既定用途一致。物理分析方法也可分成4 种验证类别。例如，光谱定量方法的验证，按照方法的要求，可用类别或类别的分析运行特性进行评价。物理性质定性实验，如粒度、表面积、堆积密度和敲密度，可能与运行特性有关，常用类别的特性，类别分析运行特性常用语光谱定性鉴
23、别实验的验证。然而，不同分析目的要用到各种技术，选择类别验证各个方法时，应考虑方法的特殊用途以及被分析物性质。分析方法的有效性只能用实验研究进行确认。因此，做好这类研究的总结是确定分析方法是否适合于既定用途的基本要求。法规要求见药典分析方法确认中药典分析方法确认有关原则），应显示在实际应用条件下现行药典分析方法的适用性。总结中最好附有对新的或修订的药典分析方法的建议。药典分析方法确认本通则目的是为用已有人员、已有设备和试剂首次按药典分析方法检验并要得到可接受结果提供确认方法。本通则并非为了对已经成功建立好的实验室分析方法追溯其实用性。通则药典分析方法验证对递交拟收载入USP-NF 的分析方法列
24、出了各种实验类别和所附文件需考虑的一般验证特性。确认精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页，共 11 页10 / 11 方法包括对选定分析运行特性的评估，如通则所列分析运行特性，以确认适宜的相关参数，不是重复验证过程。药典分析方法首次使用者不要求对该方法进行验证，但应有文件确定在实际应用条件下该方法的适用性。在美国，此项要求规定在21 CFR 211.194(a现行药品生产质量管理规范中，规范规定：“ 采用的所有检验方法的适用性均应在实际应用条件下进行确认” 。本通则不包括微生物检验方法的确认，因USP有关通则已经包含，如抗菌效力检
25、测 51、非无菌制剂的微生物限度检查法：微生物计数法61、非无菌制剂的微生物限度检查法：控制菌检查法62、无菌检查法 71、药典品种微生物回收的验证1227。确认过程能正确理解并照药典分析方法依法检验的人员，应具有一定经验和知识并受过培训。检验人员对药典分析方法应进行确认，确认结果应确保药典分析方法能按既定要求进行。如果药典分析方法确认不成功，并且美国药典会人员的协助也不能解决问题，则说明该方法不适用于该单位供试品种的检验。可按凡例与要求规定研究和验证替代方法。该替代方法应递交USP，并附必要数据，以便该替代方法作为现行药典方法收载或替换现行药典方法。确认要求药典分析方法确认的要求应基于对该方
26、法以及用该该方法检验品种复杂程度的评价。虽然在实际应用条件下确认适用性不需要做全部的再验证，但通则表 2 所列某些分析运行特性可选用于确认过程。只需要评价适合于特定方法确认的那些特性。确认过程的程度和深度取决于检验人员的培训水平和经验、分析方法的类型及相关设备或仪器。特定的分析步骤以及被测定品种。举例说明，药典分析方法用于原料药和制剂含量测定适用性的确认，专属性评价就是关键工程。例如，用系统适应性分离度是否符合要求来确认色谱法的可接受专属性 。但是，原料药来源不同，含有的杂质情况可能不同，拟采用的药典分析方法不一定适用。同样，对于药物制剂所用辅料，不同生产厂生产的辅料质量差异十分大，可能直接干
27、扰分析方法或形成杂质，使拟采用方法不一定适用。另外，药物制剂中含有的不同辅料、抗氧剂、缓冲剂、或容器本身的溶出物，均可能对测定方法产生干扰。在这种情况下，对特定原料药或药物制剂，应进行更充分的专属性评价，以显示拟采用分析方精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页，共 11 页11 / 11 法对特定原料药或药物制剂的适用性。其他分析运行特性，如检测限或定量限，以及精密度评价，对杂质分析可能有用，可显示在实际应用条件下拟采用药典方法的适用性。常规进行的基本药典检验方法不必进行确认，除非该药典方法不适用于供试品种。基本药典检验方法例如但不限于，干燥失重测定法、炽灼残渣测定法、各种容量分析法，如酸值测定，以及简单仪器分析法，如PH 值测定。但是，首次将已经建立的常规方法用于药典品种测定时，对于新的或不同的样品处理和溶液制备要求，建议考虑方法确认的必要性。5、以下空白。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页，共 11 页