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1、分析方法开发与验证在不同行业有不同的要求，医药化学行业对于质量的控制非常严格，高效液相分析是控制产品质量的重要手段，其开发与验证对其它行业有很好的借鉴意义。一、分析方法开发分析方法的开发主要包括色谱柱的选择、流动相的选择、 检测波长的选择和梯度的优化几个方面。目前高效液相多做反相使用，所以本文主要以反相为例进行讲解。1.色谱柱的选择原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，要求检测使用的色谱柱有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度，从而对可能存在的杂质有更大的分离的可能性，所以5um填料的色谱柱长要250mm， 3.5um 填料的柱长要150mm， 基本上都是各个粒径柱长最长的。我比较喜
2、欢近两年新出的亚二微米填料的色谱柱，50mm 柱长就能提供很高的理论塔板数，而且柱长和粒径小了，流速增加很多，能节省很多的分析时间，极大的提高工作效率。一般选用直径为4.6mm 或 3.0mm 的柱子，太细了可能会增大柱外效应。填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的分析柱都在100A 左右，能满足分析检测的需要。对于 API 分析方法开发，一般要求必须做色谱柱的筛选实验，最少使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要来自于不同厂家。三种类型包括：1)普通的 C18 或相应的 C8 色谱柱，如 Waters 的 Symmetry C18 或 C8， YMC 的 Pack Pro C18或
3、 C8，Agilent 的 RX C8 等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；2)封端处理的或者极性嵌入型色谱柱，如Waters 的 Symmetry Shield RP18 或 RP8，XTerra RP18 或 RP8，YMC 的 ODS AQ ，Agilent 的 Zorbax SB AQ 等，其它公司如菲罗门和热电也有相应的色谱柱；3)填料用其它官能团修饰过的色谱柱，如苯基柱等，很多公司都有。一般不同类型的色谱柱在选择性上会有很大的差异，相同类型的色谱柱生产厂家不同在选择性上也会有差异， 这个主要是填料的性质和生产工艺决定的，有时候用一只色谱柱分离不好，除了优化梯度和流动相外，换
4、一个厂家的柱子也是一个很好的选择。相同品牌型号的色谱柱，C18 和 C8 在选择性上没有差异，但是C18 保留能力更强，相同的样品分离度更高，我们一般倾向于选择用C18。 我们在筛选色谱柱时尽量选择行业内排名前几位的厂家，柱子品质好，开发分析方法时能省很多力气，做出来的分析方法也有保证。一个药从开发到上市可能会持续十几年甚至更长时间，厂家有实力， 开发方法时选定的柱子在若干年以后需要时还会有的名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 7 页 - - - - - -
5、- - - 买，做分析时重复性也能保障。多用几只色谱柱做筛选和分析方法优化，能尽最大的可能提高分析方法的质量，保证检测结果的可信度。我比较喜欢用的柱子有：Agilent 的 Zorbax Eclipse XDB-C18 、 Zorbax Eclipse Plus C18 ， Waters的 Symmetry C18 、 XTerra RP18 、 XTerra MS C18 等， YMC 的柱子有时会是不错的备用选择，菲罗门的柱子菲罗门的柱子国内外市场占有率较高，但是感觉柱子压力高，寿命短， 尽量不用，热电的柱子用的也不少，但没什么感觉。制剂分析方法选择色谱柱的要求基本和API 相一样，对于中
6、间体和生产过程中反应跟踪（IPC）分析方法开发使用的色谱柱，我们一般会根据样品性质直接选取一两只普通C18 或者封端处理过的色谱柱，简化筛选过程。2.流动相的选择常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高， 毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性， 所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。 但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的
7、选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、 高氯酸、甲基磺酸等， 其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最合适， 三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH 值，从而改善样品的分离度和峰形。相同进样量样品
8、峰越高则意味着峰形越好，从图中可以看出多数样品在低pH 值下峰形都比中性要好， 这个主要是由色谱柱本身的性质所决定的。色谱柱主要都是硅胶基质，现有的填料处理工艺无法将硅胶上残余的硅羟基全部去除，硅羟基会造成样品峰拖尾，一般认为硅羟基的 pKa 在 3.5 到 4.5 之间，低 pH 值能帮助抑制硅羟基的活性，减小拖尾， 从而改善峰形，提高分离度。水溶液中添加0.1%（体积）的磷酸或者三氟乙酸其pH 值大概在 2 左右，用作流动相正好抑制硅羟基的活性，所以开发液相分析方法时流动相首选水加0.1%的磷酸，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - -
9、- - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 7 页 - - - - - - - - - 然后再以此为基础做优化。在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、 缓冲能力强、配制简单，需要调pH 值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋酸盐，常用的盐浓度在1020mM 左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问题，往往需要在流动相里添加三乙胺来减少拖尾，但是三乙胺对色谱柱的寿命有很大影响，现在新的色谱柱都不再需要了。流动相里有时会需要调节pH 值到碱性，具体pH 要视色谱柱的耐受范围而定，常用 NaOH 、KO
10、H 溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性pH 的试剂， 也可以往水里单独添加氨水做碱性流动相。在缓冲盐做流动相时，出峰太早、 峰形很差、 相似结构的化合物峰因为拖尾或峰型太宽而不能达到基线分离时，可以考虑使用离子对试剂，常用的离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐， 但是流动相里使用离子对试剂时，系统需要的平衡时间长，样品保留时间不是很稳定， 因为离子对试剂的背景吸收基线会很差，且做完样品后需要长时间清洗，所以我们尽量不使用离子对试剂。使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题， 尤其是在流动相里添加醋酸铵以后，在低波长下梯度变化时基线下降非常严重，严重
11、影响对含量较小杂质的准确定量，可以考虑在乙腈里加入10%的水，水中预先加入10 倍水溶液浓度的缓冲盐，这样梯度中A、B 两项盐的浓度相同，可以避免基线漂移严重的问题。原料药一般结构式比较大，分子构成比较复杂，开发分析方法时用水加磷酸效果可能效果不好，通常还要求最少尝试2 和 6.5 两个 pH 值的磷酸盐缓冲溶液，并依据结果对流动相进行pH 优化，如效果不理想再进一步尝试其它缓冲盐溶液。开发中间体或者IPC 的分析方法时可以根据经验酌情简化流动相的选择过程。3.梯度的优化梯度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样品的保留时间，优化样品的分离度。 有机相起始比例越小，样品保留时间
12、越长，随着梯度的改变，样品出峰的先后顺序也有可能改变。 我们做梯度优化时主要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采用了新的封端工艺，或者内嵌极性基团，耐水的能力都比较高。在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在，极性较大，为了提高样品的分离度，尽量使用大比例的水做梯度的起始。对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组成改变时不能有盐析出。对于水加0.1%磷酸的流动相，开始时可以采用95%的水做起始，以95%的有机相结束，注名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3
13、 页，共 7 页 - - - - - - - - - 意根据实际情况在梯度最后用大比例的有机相冲洗几分钟，以保证把小极性的杂质洗脱下来，防止样品残留到下一针。梯度的斜率一般采用凹线型的先小后大，梯度变化先慢后快，在此基础上再对梯度进行优化。使用缓冲盐溶液的梯度水相起始比例一般要从1020%开始，为了防止盐析出， 在梯度最后避免用纯的有机相做冲洗，梯度斜率采用恒定的就可以，在此基础上根据方法运行的情况对梯度进行调整。一般一个API 的样品采集的时间控制在4050 分钟左右，样品出峰在1520 分钟左右比较好，如果有极性非常小的杂质存在可以在最后加一段时间的大比例有机溶剂冲洗色谱柱，最后再设置10
14、 分钟左右的重新平衡时间。中间体和IPC 的样品分析方法时间可以根据需要减半或者时间更短。4.波长的选择做分析方法开发需要二极管阵列检测器，做色谱峰纯度检查和选择检测波长，通过色谱峰纯度检查来保证主峰里没有掩盖其它杂质，做纯度检测对波长选择的要求比较简单，原则是把尽量多的杂质在色谱图上体现出来。很多杂质只有在低波长下才有紫外吸收，所以我们选择尽可能低的波长，乙腈的截止波长在190195nm，用乙腈做流动相检测波长可以选择在210220nm。也有公司要求分别选取产品紫外吸收最强的波段和210220nm 两个波段做对比，哪个纯度低以哪个为准，这样可以更严格的控制产品的质量。二、分析方法验证为了保证
15、分析检测结果准确、可靠， 必须对所采用的分析方法的准确性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法符合检测项目的要求。方法验证在质量控制上有重要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是制订质量标准的基础。方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。1.专属性专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。 对于纯度检测
16、， 可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品， 考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪， 可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。一般要求产品和杂质之间的分离度大于2.0。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 7 页 - - - - - - - - - 2.线性线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原料或产品的浓度呈线性关系的程度。线性是定量检测的基础， 需要定量检测的项目都需要验证线性
17、。一般用贮备液经过精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5 个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。3.范围范围指在能够达到一定的准确度、精密度和线性时， 样品中被分析物的浓度区间。简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度最大值和最小值。需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80 120。4.准确度准确度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得分析方法均需要验证准确度。准确度应在规定的范围内建立，对于原料药可用已知纯度的标准品或符合要求
18、的原料药进行测定，必要时可与另一个已建立准确度的方法比较结果。5.精密度精密度是指在规定条件下，同一均匀样品经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度。精密度一般用相对标准偏差表示，取样检测次数应至少6 次。精密度可以从三个层次考察：重复性、中间精密度、重现性。a、重复性是在相同的操作条件下、较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。一般是用100浓度水平的样品测定6 次的结果进行评价。b、中间精密度：同一实验室，在日期、分析人员、仪器等内部条件改变时，测定结果的精密度。c、重现性：指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。6.检出限检出限是指样品中的被分析物能够被检测到的最
19、低量，不需要准确定量。检出限体现了分析方法的灵敏度。 检出限的测定可以通过对一系列已知浓度被测物的试样进行检测，以能准确、可靠检出被测物的最小浓度来确定，也可把已知浓度样品的信号与噪声信号进行比较，以信噪比为 3：1 时的浓度确定检出限，一般要求能够达到进样浓度的0.05%。7.定量限名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 7 页 - - - - - - - - - 定量限是指样品中的被分析物能够被定量检测的最低量，其测定结果需要一定的准确度和精密度， 定量限体现
20、了分析方法灵敏定量检测的能力。检测需要严格控制含量的杂质，必须考察方法的定量限， 以保证杂质能够被准确定量。一般以信噪比为10：1 时相应的浓度或进样量来确定定量限。8.耐用性耐用性是指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干扰能力，主要的变动因素包括：流动相的组成、流速和pH 值、色谱柱、柱温等。经试验，应说明小的变动能否符合系统适用性试验要求，以确保方法有效。9.系统适用性试验液相色谱分析方法主要依赖高效液相色谱仪和色谱柱，在做方法验证时，有必要将高效液相色谱仪、色谱柱、流动相与实验操作、待测样品等一起当作完整的系统进行评估，并将系统适用性作为分析方法的
21、组成部分，系统适用性便是对整个系统进行评估的指标。一般系统适应性的要求为：分析方法能够达到0.05%的检出限，主峰的拖尾因子0.5Tf2.5 ，主峰与杂质的分离度大于2.0，空白干净，主峰处无系统峰干扰。分析方法开发与验证是一个整体，在实际工作中， 一般是先开发分析方法，经过适当的优化以后再做方法验证，验证的部分内容在分析方法开发时就要做，比如说分析方法的专属性验证。分析方法验证并非必须验证所有的内容，只要注意验证内容充分，足以证明分析方法的合理性就可以了，如杂质限度检测一般只需要验证专属性和检出限，而精密度、线性、定量限等涉及定量测定的项目，则不需要验证。有时需要对分析方法进行全面或部分的再
22、验证。当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新的杂质， 杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。当分析方法发生部分改变时，如检测波长发生改变，则需要重新进行检测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，以证明改变后的分析方法的合理性、可行性。内标与外标的应用内标法：选择适当的物质作为内标物质，定量加入被测样品中，跟据被测组分和内标物质的峰面积之比，乘以校正因子，对映内标物质加入量所进行含量测定方法。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - -
23、- - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 7 页 - - - - - - - - - 内标法的优点：色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高；缺点：选择合适的内标物质比教困难。外标法：又称标准曲线法，依照测量标准品所绘制的曲线来计量被测样品的含量的方法。外标法的优点：简单，适和大量样品分析。缺点：每次色谱条件很难相同，容易出现误差。请问大家在做含量测定时依照什么原则来选定方法的？我们一般作体外药物分析时均采用外标法，体内药物分析， 因提取步骤烦琐，都采用内标法进行校正， 但如果仪器稳定、方法的重现性好，也可使用外标法，国外体内药物分析用外标法的也有不少，但本人认
24、为最好使用内标法。实际样品检测用外标法的更多。原因：1.内标物难获得，特别是同位素标记的有相近行为的内标物；2.操作步骤多、计算烦琐如在新药报批中使用内标物，则需报送内标物的结构确证资料，在报生产的同时还要报送此内标物对照品。所以现在连SDA 的专家都不推荐使用内标法。最初使用内标是因为进样器进样不准确，采用内标可以校正进样误差。现在的HPLC 用定量环进样准确度很高， 加了内标有时候因为操作的误差反而降低准确度。在药物质量检验中，如果是原料药， 或者制剂的成份不很多，用外标法即可， 不一定非要用内标法，而且现在越来越多的标准都放弃了用内标法。对于体内药物分析，分析方法的误差反而不是那么的重要，而在样品处理的过程中引入的误差要引起足够的重视，所以，一般在处理过程中加入内标以校正误差。这个时候， 回收率的高低又不是绝对的要求很高，虽然要求绝对回收率在70%或者 80%以上，但是，有时候低一些也无所谓，关键是回收率的稳定性，测定的重现性。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 7 页 - - - - - - - - -