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1、第25卷第2期 生物医学工程学杂志 v0I2s No21111垒兰旦 竺墅型堡垒垫塑型!堡!星型望!鲤望星 垒鲤!壁垒垒基因治疗在肿瘤过继性免疫治疗中的应用王 纯1综述 赵阳兵2 审校1(成都体育学院运动医学系，成都610041)2(Surge哆Bmch，NationaI Cancer InStitute，National InStitut酋of Health，Betl岱da，Maryland 20892，USA)摘要过继性输注肿瘤浸润性淋巴细胞(T1Ls)能可靠地治疗转移性黑色素瘤，并使其有效率稳定在50左右。但由于受TIL来源的限制，大多数非黑色素瘤病人无法使用过继性免疫治疗。使用抗肿瘤抗
2、原TCR修饰的T淋巴细胞成功用于黑色素瘤病人的治疗为非黑色素瘤癌症病人的过继性免疫治疗提供了方向。本综述介绍了近几年来肿瘤特异性过继免疫治疗的进展，重点介绍基因修饰的T淋巴细胞的应用及存在的问题，并展望了发展前景。关键词过继性免疫治疗肿瘤基因治疗T细胞受体中图分类号R73051 文献标识码A 文章编号10015515(2008)020482一05Appl ication of Gene Therapy in Tumor AdoptiVe Immunotherapyw锄g ch吼1 Zh舯Y锄gbin酽1(oP“跏n【Jkiz舸s毋，CIl即“61004l。C航船)2(S“俘DIBm砌，N口如撒
3、z巳懈rh时打沈痂，垃zf版i抛觚D，k枷B砒磁口拖批耐20892嗍)Abstmct Adaptive cell七咄nSfer 0f tun协一infiltrating l卿唧e(TIL)h弱resulted in clear and reprodudbIe respons签in a substantial percenta罢re(50)of patients州th metastatic melanomaThe删labili哆of tLmf rctiVe TIL1imitS the use of adaptive cell tmsfer fbr the trea廿】肥nt of most no
4、n-melar籼cancer pati朗tsRe。ent rep了rt indicatedthat adoptive t删1Sfer of T lyrnphOcyt签g朗etically modifed诵th T-cell rec印tor(1I)against a tumor antigen r签ultedin objtive response in md蝴patits-thus shedding light on the use of thb stmt弓gy f西the trtnlt of o。眦瑚印一ithelial cancers beyond melarmaIn this re啊ew，
5、the current status and potentiaI u跄of genetic n划ifition in the adoptive ir啪unotherapy of canc口patients are be discussedKey帅rds Adoptive immunotherapy TllrI埘G嘶e therapy H、R1 引 言肿瘤免疫治疗大体可分为主动与被动免疫治疗。主动免疫治疗主要是肿瘤疫苗的运用，用肿瘤疫苗的目的是克服因肿瘤产物造成的免疫抑制状态，增强肿瘤相关抗原(TAA)的免疫原性，刺激特异性免疫来攻击肿瘤细胞。被动免疫主要是应用细胞因子、单克隆抗体或免疫活性细胞
6、。过继性免疫治疗就是把分离的肿瘤特异性T淋巴细胞在体外培养活化扩增后回输给病人。美国国立癌症研究所外科在19952004年用各种不同的肿瘤疫苗治疗1 306例癌症病人，总的客观有效率为33。虽然目前临床单独应用肿瘤疫苗的有效率不高，但在通讯作者。Bmail：c哪n98509163咖动物肿瘤治疗模型中，联合应用肿瘤疫苗的作用非常大。动物实验已经证明，肿瘤疫苗与特异性过继免疫结合可有效治疗实体肿瘤【2J。众所周知，大多数仉蚺是自身抗原，由于胸腺的选择机制和耐受机制，机体针对这些抗原产生的T淋巴细胞的大多数T细胞受体(TCR)的亲和力都比较低，从而限制了其肿瘤识别及杀伤效果。将克隆的高亲和力识别TM
7、的TCR(或嵌合受体)通过转基因技术转给T淋巴细胞，可以使重定向的原来无肿瘤识别能力的T细胞在体外和体内有效地识别并杀伤肿瘤细胞3|。本文综述近几年的肿瘤特异性过继免疫治疗的进展，尤其是基因修饰的T淋巴细胞的应用及存在的问题，并探讨其发展前景。万方数据筮2翅 王纯簦。 基固迨痘连壁瘪过缝燃鱼瘥迨痘史笪廑旦 堡墅2配R重定向的T淋巴细胞的应用临床研究表明，过继性输注肿瘤特异性T淋巴细胞可通避挪测黪瘸缨胞的生长恧有效的治疗瓣瘤。临床应用的肿瘤特异性T淋巴细胞可从肿瘤病人的外周血、淋暇结或者肿瘤组织中分离。目前临床应用牌瘤浸润淋巴缨胞(譬l乙)可褥剽较稳定盼可重复性的治疗效果。在早期的临床试验，用T
8、IL对未作免疫抑制预处理的肿瘤病人进行过继免疫治疗，并褒察委一定的疗效H】。薅近来采用对艟瘤瘸人先进行免疫抑制预处理，再输给经过体外筛选扩增的自体TIL，明照地提高了治疗效果，可取得50稳定酶、可重复的治疗效莱(采用标准萎迈elST指标)【5，61。值得注意的是这犊病人大多有较大的多发转移病灶，并且对化疗、放疗及其它免疫治疗耐受。遗憾酶是，劐銎蓠为止，Tl乙的过继免疫治疗很难推广到除黑色素瘤外的其他肿瘤。虽然TIL亦有用予其他肿瘤免疫治疗的报道，但凭明显治疗效果，究其漂困，一是霆蠹其它瓣瘤提供TlL没有黑色素瘸那么方便；其次，更重要的是大多数来源予非黑色素瘤的TIL在体外培莽后没有抗肿瘤效果。
9、此外，铜备互l己需要薪鲜的耱瘤组缓和长时闯的缨胞培养，与相应的费用加在一起考虑，使之能在临床研究阶段以外的实际应用成为问题。TCR是T细胞表瑟特异性识别抗原纛奔导免疫应答的分子。TCR主要识别由组织相容复仑物分子提呈的抗原分子多肽。基因转肄抗原特异性TCR，使受者T淋巴细胞获得供者酶抗原识别特异性，巍瓣瘤过继性免疫治疗提供了更广阔的应用前景。随着越来越多的A的发现及相应的TCR的克隆表达，大量的体外实验及动物实验证鹱用挽仉气A的T(、R重定向的T细胞具有特异性的肿瘤杀伤功能37，8J。在美国国立癌瘢研究所进行的一期临床试验中，对17铡转移往黑色素瘤病人用Ma撸l TCR基因修饰的自体外周m T
10、淋巴细胞进行治疗，两例病人出现客观疗效，这是目前为止世界上唯一灞辨阕盘T淋巴细胞有效治疗肿瘤病人的报道，也是首次基因治疗有效用于肿瘤免疫治疗的报道。在该巍侧病人巾持续检测到高达4070的外周盘细胞中含有基因标记，并且长达一年之久【9I。尽管总的有效率还远远低于TIL的治疗，但这对非黑色素瘤肿瘤病人的治疗提供了诱人的前景。可以相信，随着夏多更好的TCR豹发现及治疗方案的改善，有望在用基因修饰的T淋融细胞治疗肿瘤方露取褥突破进展。就曩翦懿情况来看，决定砌t重定向T细胞治疗效果的因素主要有以下三个。2。lK震的亲合力a黼ni锣)现已证明表达高亲合力TCR的T细胞更能有效地清除机体睫戆病愿俸及脾瘤缨跑
11、。J蘸ns等【10j通过从抗Mart1的TIL中克隆砌王，并将这些T(讯转入外周血T淋巴细胞中，比较表达这些曩豫麓T缨胞对抗原的亲纛力及肿瘗谖舅霸杀伤功能，其中的F5克隆的亲和力及肿瘤识别及杀伤能力都远远高于已用于临床研究的F4克隆引。作者攉断，西曩豫的稳床应用有望提高豫乏基因转导T淋巴细胞的治疗效果。Ell于受胸腺阴性选择的限制，人们无法得到亲纛力高于生理限度外的联慕(带这蕊双聚的T细胞已在胸腺中被剔除)，但通过其他途径，比如用人肿瘤抗原免疫期A转基因鼠，或直接将TI豫在体辩突交，可获褥亲合力很离，甚至毒常高(骞予正常一百万倍)的TcR【1l】。研究表明，这些高亲和力的TCR，如鼠抗人p53
12、 TCR和突变的抗NY麟艾)-lR豫【12】，英瓣癣识别稻杀伤能力雳显离于生理条件下产生的TCR。2。2罩细胞的体外扩增T细胞输阐给病人前必须经刺激扩增至足够数量(1091011)，丽过度刺激和增殖的T细胞在体内豹功麓甓显受攒，影嚷其发挥正常功麓。动物实验发现，晚期效应T淋巴细胞虽然体外活化及杀伤功能明显强于幼稚T淋巴细胞，但体内的抗肿瘤效果与其活化程度戚反沈醵引。因此，优化T缨胞体外培养扩增条件有望进一步增强治疗效果。常用的逆转录病毒载体无法直接将基因转入未刺激的T细胞，慢病毒载体可转导不增殖缨胞，及丽可减少淋融细胞的体外刺激，使其在输入病人体内时处于较幼稚的状态。自介素2(102)蹙常规培
13、养及扩增淋巴细胞的缨胞因子，l乙2不但会进一步活化淋巴细胞，而且还会诱导CI)4CD25阳性的调节淋巴细胞的产生1 4|。动物试验表明，与l乙-2不同，用ILl5和I乙-2l培养淋跫细胞，可使细胞处于较幼稚的状态，具有更强的肿瘸治疗效果15-16】。N0tch信号在T细胞分化中起着决定性作用，用造搬予细胞在体外分化T细胞的方法的建吏，使大量获得高效率转基因幼稚淋巴细胞成为可能。我们已成功应用这一技万方数据堡 皇鏊鬻堂三壅娄叁壹 墓堑鲞术，在体外培养出由CD34+造血干细胞分化的，经残浆转导的具有特异健脞瘤抗原识别及肿瘤杀伤的T细胞(1引。这一结果不但使体外制备基因转导幼稚淋巴细胞成为可能，还为
14、转基因造血干细胞的脾瘘免疫治疗提供了理论依据。23病人的预处理及输入细胞中的辅助T淋巴细胞早期使用克隆的a)8十肿瘤浸润淋巴细胞治疗未做免疫抑制预处理的病人，其疗效非常有限。临床实验发瑷对病人预处理及输入含毒+的辅劲缨胞对促进疗效起着非常重要的作用56I。此外，动物实验发现，大剂量全身照射并辅以造血干细胞支持霹显著增强牌瘤抗原特异性T继耱治疗肿瘤的效果【18。目前认为，化疗或大剂量全身照射预处理即可以清除病人体内淋巴细胞，包括调节性淋巴细胞，减少原有的细胞与输入的淋巴缨施对缩脆因子和存活环境的竞争，从而有利于输入淋巴细胞的存活和扩增；同时，大剂量全身照射预处理时输入的造盎予细胞有促进输入的善细
15、胞杀伤瓣癯的功撩。在输入TCR转导的抗掀一类肿瘤抗原限制的CD8+T细胞的同时，给予H】忪二类抗原限制的抗相同肿瘤抗原的曩疆转导的CD25串细臆去除的辅助淋巴细胞，可望进一步提高基因修饰的淋殴细胞的治疗效果。由于抗HLA二类肿瘤抗原的特异性KR不容易获得，入们尝试用抗眦一类耱瘤抗原的特异性TCR转导的C1)4淋巴细胞来提供辅助性功能【7，8I。另外，体外实验发现，转导体外突变的高亲合性的酣A2限潮性的NVESGl特异性T(聚的CI)4+T细胞具有很强的肿瘤识别功能【】2l。但是，输注表达HLA一类限制性的代R的旺)4 T淋巴细胞是否象表达H乙A二类抗原限制性的TCR一样发挥辅助功能，尚有待临床
16、或临床前期试验来证实。3嵌合抗原受体(CARl的应用辨淑是逶过基因工程技术重缀的免疫受体，既具有单克隆抗体特异性结合抗原的特性，又熊激活淋巴细胞19。与TCR相比，CAR最主要的优势是其识弱抗原不受H汝眼剑，识剃麴抗原无霭瞰提呈。但CAR只能识别细胞表面表达的抗原分子。因为G咏识别T从无需HLA限制，并且制备eAR无须事先克隆抗原特异性T淋巴缨胞，所以熙CAR来修饰T细胞具有定的优越性，亦有着较广泛的应用前景。除了一个报道有基因修饰的细胞轻发攻击正誊组织辨，铡冒蘸为也，C鳗修饰的T淋巴细胞在一期临床试验治疗中无明显疗效。但是，o幔的临床应用是安全的。目前报道的所有临床应用麴a状的信号传导均使躅
17、a)3链，翼嚣近来鹩研究发现，只用CD3链作为信号传导会导致活化的淋巴细胞凋亡，而在单链抗体与CD3之间加入共刺激分子(28或4一王攫；)能有效缝增强活诧淋巴细胞的功能并防止细胞凋亡。另外，所有的上述报道中的病人均未使用化疗(或照射)进行预处理，这可能也罴无甓曼洽疗效果的原因之一。4造血千细胞的基因治疗造盎詈缨胞移植已常规用于矗滚系统疾病稻瓣瘤的治疗，由于其多能分化、自我维持和自我更新特性，造血干细胞一直被认为是较理想的基因治疗载体细胞。躐tmo豫研究组【】将转有编褥抗ovA的HLA一类及二类TCR分别转入小鼠造血干细胞，并移植给接种有表达oVA的肿瘤细胞的小鼠。在配合树突状细胞疫苗注射接种的
18、条件下，观察笺小鼠外周m中有抗原特异性T淋巴细胞并发现肿瘤的消失。在体外T细胞分化系统中，我们成功地将转有抗肿瘤抗原联豫的入a)34+造斑手细胞分化成为具有肿瘤抗原识别及肿瘤杀伤功能的T细胞【17J。T(豫转导的人造血干细胞体外在Notch信号刺激下分化成具有抗肿瘤抗原活性的T淋巴缀胞，提示如果将转有肿瘤抗原TI隙的人34十造成于细胞辕给肿瘤病人，这些转联、R的造趣干细胞会重建税体免疫系统，产生带有转导KR的淋巴细胞并发挥肿瘤杀伤功能。同时，由于T(礞的表达有等位基因排斥作用(allelic eXcl璐i(m)，表达转基因联、R的T细胞将不会表达内源性的联汰，从而避免了因T(淑错配而产生自身免
19、疫的可能。因此，转基因造血予细胞移植对莠孛瘤病人的免疫治疗具有极其广泛而诱入的应用前景。S异体I淋巴细胞的应用应用囱体T淋巴细胞作为细胞来源限制了过继性免疫治疗的应用范围，难以推广到更多的病人。邂此，T港毽细骢的异体移植一直是移撬秘免疫治疗领域研究的热点。较造血干细胞而言，由于会导致移植物抗宿主反应(G1mD)，T淋巴细胞异体移植的应愚有一定的难度，但并不是不能克服的。研究发现，T细胞本身有促进移植物存活的作用，并与万方数据筮2塑 王丝笠。 基垦渔痘垄盟擅遒丝壁鱼壅迨痘生数廛旦 !墅T细胞表达的CD8和飚L有关。所以，T细胞的异体移植主要需克服的是G。就TCR转导的T细胞异体移植而言，有数种方
20、法可用于去除可能引起G的异体反应：(1)CD69和CD25为细胞激活标记。可用来去除有针对受者的异体反应细胞。将供者的T细胞与受者的细胞进行单向混合淋巴细胞培养，异体反应细胞则会表达CD69和CD25，通过多轮的CI)69和CD25的去除，可将异体反应细胞减少到最大限度，从而有效防止G的发生。(2)运用抗第三者(antithird party)T细胞。把用与受者无关的第三者细胞(或抗原)刺激供者的T细胞而产生抗第三者的T细胞输给受者，如通过将抗肿瘤抗原的TCR转给抗某一特定抗原(如流感等病毒)的淋巴细胞，这种T细胞中将不含抗宿主的异体反应细胞，可有效避免注入的淋巴细胞对宿主的攻击。(3)最近的
21、研究表明，用可溶性的L来处理被受者细胞刺激后的供者T细胞，对受者细胞刺激反应的T细胞(异体反应细胞)将通过激活诱导的细胞死亡而被清除。(4)通过将HSVTK自杀基因导入T淋巴细胞然后输给病人，必要时可以清除输入的淋巴细胞以避免产生G。6 NK细胞与CIK细胞的应用NK细胞又称自然杀伤细胞，属于大颗粒淋巴细胞。来源于骨髓，占外周血淋巴细胞总数的510，具有广谱抗肿瘤细胞作用。特别是对不表达H】A一类抗原的肿瘤细胞，NK细胞的非MHC限制性肿瘤杀伤功能尤为重要。NK细胞可在体外大量培养。在使用肿瘤特异性TCR转导的T细胞治疗过程中，肿瘤的免疫逃避特性会使HIA弱表达或不表达的肿瘤细胞选择性的生长，
22、从而增加了基因修饰T细胞的治疗难度。配合使用基因修饰NK细胞则有望进一步增加治疗效果。使用单链嵌合受体，则可使NK细胞具有特异性和非特异性双重肿瘤杀伤功能21I。此外，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)是一群特殊的具有NK细胞活性的TCR alpha瓜ta阳性T细胞，也是目前较为广泛地应用于临床的免疫活性细胞。如果经过进一步的基因修饰，可望明显提高CIK的应用范围及效果。总体说来，以上所讨论的每个方面都有美妙的应用前景，并且大多已经用于或正在准备用于l临床治疗。除了针对上述的NY琰n1和p53外，目前还有许多潜在的肿瘤靶抗原也已准备用于临床，如PSA、PM&、ErbB2、CDl9CD20、C
23、EA，t”inease、survi、，in及v】勰等。其中有些是单链融合抗体。基因修饰的T淋巴细胞经体外培养和扩增后其生物学特性不可避免地会有所改变，因此，用TCR修饰的同时也对T细胞的粘附分子、共刺激分子、细胞因子、与细胞调亡有关的分子以及一些调节分子的表达进行基因修饰干预，如选择性增加或抑制下列的相关分子：cI62L、CCR7、CD27、CD28、41BB、oX40、IL广2、IL广15、IL21、telomerase、BCL2、survivin、风、A4及潞1等，将有望更有效地在病人体内发挥TCR重定向T淋巴细胞的功能。综上所述，临床肿瘤免疫治疗将是一个新的模式，即基因修饰的外周血T细胞
24、或造血干细胞使其具有靶向性，辅以免疫调节手段，使人体恢复和增强针对肿瘤的免疫功能。参考文献1 R(艘nberg SA，YaIIg JC，Restfo NPQ眦=er immutherapy：订u“ng hon叽d curr叽t Vacc抽箦Nat Med 2004；10(9)：9092 o煳w独WW，11lret MR，Rnkelsteh SE以“Tl啪or re一掣髑s啪and au硒hm吼ity“t仃陀versal of a fufIctionally tolerantstate of辩lf-髓ctiveC璐+TllSJ ExpMed2003；198(4)：5693 K鼬HW，Wdk啪MC
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