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1、一、多酚氧化酶的一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布名称和自然界的分布n多酚氧化酶多酚氧化酶(1,2-(1,2-苯二酚苯二酚: :氧氧 氧化还原酶氧化还原酶,EC 1.10.3.1) ,EC 1.10.3.1) 一类含铜的一类含铜的氧化还原酶氧化还原酶，催化邻，催化邻-苯二酚氧化成邻苯二酚氧化成邻-苯二醌，也能作苯二醌，也能作用于单酚单加氧酶的底物。用于单酚单加氧酶的底物。 n多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：形成对应的醌。在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚氧化酶单酚氧化酶(酪氨酸酶
2、酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双双酚氧化酶酚氧化酶(儿茶酚氧化酶儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和和漆酶漆酶(对苯二酚氧化酶对苯二酚氧化酶 laccase,EC.1.10.3.1)。n在这三大类多酚氧化酶中，在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。1 1、多酚氧化酶的名称、多酚氧化酶的名称n重要的天然底物重要的天然底物三、三、pH和温度对多酚氧化酶和温度对多酚氧化酶 活力影响活力影响1.pH1.pH对酶活力的影
3、响对酶活力的影响(1)(1)适宜适宜pHpH：4 47 7 (2)(2)不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的多不同种类，甚至同一种果蔬中的不同品种得到的多酚氧化酶，也有不同的最适酚氧化酶，也有不同的最适pHpH(3)(3)果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶, ,最适最适pHpH也有差异也有差异(4)(4)酶的提取或分离的方法对它的最适酶的提取或分离的方法对它的最适pHpH也有影响也有影响(5)(5)测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最适pHpH也有影响也有影响(6)(6)大多数多酚氧化酶只有一个最适大多数多酚氧化酶只
4、有一个最适pH,pH,在一些情况下在一些情况下, , 有第二个最适有第二个最适pHpH2.温度对多酚氧化酶活力影响温度对多酚氧化酶活力影响n不同种类、品种、部位的不同种类、品种、部位的多酚氧化酶有多酚氧化酶有不同的热稳定性，不同的热稳定性，通常最适温度在常温通常最适温度在常温n加热易使酶失活加热易使酶失活n同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的热稳定性有不同的热稳定性n低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，但活性下降比较缓慢但活性下降比较缓慢四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂 和果蔬酶促褐
5、变的防止和果蔬酶促褐变的防止n1.1.激活剂激活剂n多酚氧化酶的活性形式是含铜的酶单体多酚氧化酶的活性形式是含铜的酶单体的寡聚体，激活剂的作用是的寡聚体，激活剂的作用是使酶蛋白以使酶蛋白以一定的聚合度存在一定的聚合度存在，才有生物活性。，才有生物活性。nSDSSDS、 CuCu2+2+ 、酸、尿素等、酸、尿素等2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止抑制剂和果蔬酶促褐变的防止n酶促褐变酶促褐变: :较浅色的水果、蔬菜在受到较浅色的水果、蔬菜在受到机机械性损伤械性损伤（削皮、切片、压伤、虫咬、（削皮、切片、压伤、虫咬、磨浆、捣碎）及处于磨浆、捣碎）及处于异常环境变化异常环境变化（受（受冻、受热等），在酶促
6、（催化）下氧化冻、受热等），在酶促（催化）下氧化而呈褐色，称为酶促褐变而呈褐色，称为酶促褐变n亚硫酸类是酚酶抑制剂。亚硫酸类是酚酶抑制剂。褐变防止方法褐变防止方法酶促褐变的酶促褐变的三个条件三个条件，缺一不可。，缺一不可。 即：多酚类物质、酚酶、氧气即：多酚类物质、酚酶、氧气 除去多酚类物质困难，不现实。除去多酚类物质困难，不现实。 一般为一般为 降低酚酶活性、驱氧降低酚酶活性、驱氧 (1)加热钝化酶活性加热钝化酶活性n7595、57S的加热处理，可使大部分的加热处理，可使大部分酶活性丧失。酶活性丧失。常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌 加工中，必须严格控制时间和温度。加
7、工中，必须严格控制时间和温度。加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变，加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变，但会影响食品品质；加热不足，不能抑制酶褐但会影响食品品质；加热不足，不能抑制酶褐变。变。微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风味。味。(2)螯合酶促作用的金属离子螯合酶促作用的金属离子n金属（铁、铜、锡、铝等）离子是多酚氧化酶金属（铁、铜、锡、铝等）离子是多酚氧化酶的激活剂。的激活剂。Fe3+、Fe2+、Cu2+能促进褐变主能促进褐变主要是因为铁和铜不仅能和酚类化合物反应形成要是因为铁和铜不仅能和酚类化合物反应形成褐色物质，而且能催化还原酮
8、类的氧化。褐色物质，而且能催化还原酮类的氧化。n柠檬酸对柠檬酸对Cu2+有螯合作用。有螯合作用。nEDTA是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离子对褐变反应的促进作用，但其与作用对象有子对褐变反应的促进作用，但其与作用对象有关，有的效果则不明显。关，有的效果则不明显。 (3)酸处理法酸处理法n多数酚酶最适多数酚酶最适pH67，pH 3失活失活(高酸性环境会高酸性环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致PPO逐渐失活，逐渐失活，酶活性趋于最低。酶活性趋于最低。)n常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血酸、混常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、
9、磷酸、抗坏血酸、混合酸。合酸。n柠檬酸可降低柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基，还可络合酚酶辅基Cu2+，但单独用但单独用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。 n实践证明：实践证明：0.5%0.5%柠檬酸柠檬酸 + 0.3%+ 0.3%抗坏血酸抗坏血酸效果好。效果好。n抗坏血酸不但能降低体系抗坏血酸不但能降低体系pH，而且具有还原剂的作用，而且具有还原剂的作用，可将体系中的醌类及其衍生物还原成酚，并通过自身可将体系中的醌类及其衍生物还原成酚，并通过自身氧化来减少体系的含氧量。氧化来减少体系的含氧量。 （4）酶活抑制剂酶活抑制剂亚硫酸类是酚酶抑制剂。亚硫酸类是
10、酚酶抑制剂。 常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钠、 焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠(Na2 S 2 O 4 ) 如：如：在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。用二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。 实验表明：实验表明：10ppm可抑制酚酶活性，但有挥发可抑制酚酶活性，但有挥发损失，还与醛类加成等。实际应用损失，还与醛类加成等。实际应用300ppm，残，残留留 20 ppm。 在微酸性（在微酸性（pH6）时，抑制酚酶的效果最好。）时，抑制酚酶的效果最好。 防止原因有三防止原
11、因有三： a.a.抑制酶活性抑制酶活性b.b.将醌还原为酚将醌还原为酚 c.c.与醌加成，防止聚合与醌加成，防止聚合(5)驱氧驱氧n通过沸水烫漂、抽真空（通过沸水烫漂、抽真空（93kPa，515min）、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调包）、高浓度抗坏血酸溶液浸泡、气调包装设计等均可达到驱除食品内氧气的目的，从装设计等均可达到驱除食品内氧气的目的，从而抑制酶褐变的发生。而抑制酶褐变的发生。n控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂等控制氧气含量用抽空处理技术或添加去氧剂等方法：用方法：用2%食盐食盐+0.2%柠檬酸柠檬酸+0.06%偏偏重亚硫酸钠溶液作抽空液，在重亚硫酸钠溶液作抽空液，在500mmH
12、g的真的真空度抽空空度抽空510min,可取得良好的护色效果。可取得良好的护色效果。 褐变的利用褐变的利用期望的褐变期望的褐变苹果酒、红茶发酵（生成茶红素）、可可苹果酒、红茶发酵（生成茶红素）、可可粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。粉、葡萄干、梅干、椰枣、无花果。红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是红茶是全发酵茶，茶中的多酚物质主要是儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用，儿茶素经多酚氧化酶与过氧化物酶的作用，氧化并聚合生成茶色素。氧化并聚合生成茶色素。红茶中含有三种酚性色素红茶中含有三种酚性色素茶红素、茶茶红素、茶黄素和黄酮醇甙。黄素和黄酮醇甙。五、多五、多酚酚氧化酶的分子形式氧化酶的分子形式n
13、多酚氧化酶有多种分子形式多酚氧化酶有多种分子形式n原因：类似的亚基不同程度的聚合；原因：类似的亚基不同程度的聚合；不同亚基不同方式的结合不同亚基不同方式的结合; ;酶蛋白酶蛋白质构象的改变质构象的改变; ;前三种情况的结合。前三种情况的结合。n多酚氧化酶多种分子形式之间的差别表多酚氧化酶多种分子形式之间的差别表现在底物特异性、最适现在底物特异性、最适pHpH、温度稳定性、温度稳定性、对抑制剂敏感性、氧化和羟基化活力的对抑制剂敏感性、氧化和羟基化活力的差别。差别。六、多酚氧化酶活力测定六、多酚氧化酶活力测定n多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两类类n测定底物消失的
14、速度测定底物消失的速度n测定产物生成的速度测定产物生成的速度 限于测定反应的初速度。限于测定反应的初速度。PPO活性测定活性测定n终点法终点法n多酚氧化酶多酚氧化酶催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌类反应，以儿茶酚为类反应，以儿茶酚为多酚氧化酶多酚氧化酶的的底物底物，其氧化，其氧化产物在产物在416nm416nm处有最大光吸收。处有最大光吸收。n测定系统测定系统：1.5ml 20mmol/L1.5ml 20mmol/L邻苯二酚（溶于邻苯二酚（溶于0.05mol/L,pH6.8KH0.05mol/L,pH6.8KH2 2POPO4 4-NaOH-NaOH缓冲液中，然
15、后再缓冲液中，然后再加入加入0.1ml0.1ml酶提取液，保温酶提取液，保温3737C C，三氯乙酸终止反，三氯乙酸终止反应，并应，并4000r/min4000r/min离心离心5min5min，取上清液，适当稀释。，取上清液，适当稀释。 以空白为对照，用分光光度计测定其在以空白为对照，用分光光度计测定其在416nm416nm波长波长下的下的O.DO.D值。值。 n酶活性单位酶活性单位为在测定条件下，每分钟引起吸光度为在测定条件下，每分钟引起吸光度改变改变0.010.01所需的酶量所需的酶量动态法动态法 PPOPPO活性的测定活性的测定n取取0.05mol/L,pH6.8KH0.05mol/L
16、,pH6.8KH2 2POPO4 4-NaOH-NaOH缓冲液缓冲液1.5ml1.5ml于于1cm1cm比色皿中，加入比色皿中，加入1ml 20mmol/L1ml 20mmol/L邻苯二酚溶液，邻苯二酚溶液，PPOPPO酶液酶液0.5ml0.5ml，混匀后在，混匀后在416nm416nm处比色，酶液加入后开始记时，每处比色，酶液加入后开始记时，每30s30s记录一次记录一次OD OD 随时间的变化值，以最初随时间的变化值，以最初直线段的斜率直线段的斜率( (OD/t)OD/t)计算酶活力。计算酶活力。n一个一个酶活力单位酶活力单位定义定义为：在测定条件下，为：在测定条件下，每分钟引起吸光度改变
17、每分钟引起吸光度改变0.010.01所需的酶量。所需的酶量。七、水果和蔬菜中的七、水果和蔬菜中的 多酚氧化酶及其底物多酚氧化酶及其底物n正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与PPOPPO酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列膜系统实现的，受膜系统实现的，受膜屏障的作用膜屏障的作用，这种区域性的，这种区域性的分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组织分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的区是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的区域化分布破坏，域化分布破坏，PPOPPO与酚
18、类物质接近并与其发生与酚类物质接近并与其发生化学作用，这将导致褐变。化学作用，这将导致褐变。n水果水果有更大的有着有更大的有着较弱薄片成分的细胞较弱薄片成分的细胞，冷藏时，冷藏时易发生易发生细胞壁破裂细胞壁破裂，使，使PPOPPO与酚类物质接触，产与酚类物质接触，产生褐变。生褐变。1.苹果中多酚氧化酶n引起苹果褐变的重要原因之一引起苹果褐变的重要原因之一n未成熟的苹果比成熟的更易褐变未成熟的苹果比成熟的更易褐变n在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期间是增加的间是增加的2.梨中的多酚氧化酶n梨多酚氧化酶梨多酚氧化酶仅作用于仅作用于邻苯酚邻苯酚, ,与与对苯酚对
19、苯酚、间苯酚间苯酚和和一元酚一元酚无作用无作用n以儿茶酚为以儿茶酚为底物底物, ,该酶的最适该酶的最适pHpH为为6.5,6.5,在在3030活性最强活性最强. . n亚硫酸氢钠、维生素亚硫酸氢钠、维生素C C、柠檬酸对梨中多、柠檬酸对梨中多酚氧化酶的抑制作用依次减弱酚氧化酶的抑制作用依次减弱, ,硫酸钠几硫酸钠几乎无抑制作用乎无抑制作用n不同底物和同底物不同浓度影响多酚氧不同底物和同底物不同浓度影响多酚氧化酶特性化酶特性. .3.桃桃n促使衰老的因素，可促进褐变，抑制衰老促使衰老的因素，可促进褐变，抑制衰老的因素可抑制桃果实的褐变的因素可抑制桃果实的褐变n桃低温下的褐变与逆境条件下不正常衰老
20、桃低温下的褐变与逆境条件下不正常衰老有关有关n酚类物质含量和酚类物质含量和PPOPPO活性在果实近成熟时活性在果实近成熟时下降下降，所以适当延迟采收期可显著减少桃，所以适当延迟采收期可显著减少桃组织褐变的发生组织褐变的发生4.马铃薯马铃薯n马铃薯匍匐茎、块茎、花及根中的马铃薯匍匐茎、块茎、花及根中的PPOPPO活性明显强活性明显强于叶和茎，而块茎外皮和花中子房及花药于叶和茎，而块茎外皮和花中子房及花药PPOPPO活性活性也高于同器官的其他部位也高于同器官的其他部位n马铃薯马铃薯中中PPOPPO的最适温度为的最适温度为30,30,在在8080处理处理5min, 5min, 9090处理处理2mi
21、n,PPO2min,PPO活性基本丧失活性基本丧失. .考虑到马铃薯淀考虑到马铃薯淀粉加热可能变性的特点粉加热可能变性的特点, ,在加工中在加工中不宜采用热处理不宜采用热处理的方法防止褐变的方法防止褐变. .n马铃薯中马铃薯中PPOPPO的最适的最适pHpH为为6.6,6.6,在在pH6-7pH6-7之间酶的活之间酶的活力较高力较高, ,在加工中应尽量避开此在加工中应尽量避开此pHpH范围范围, ,可可采用采用pH4.5pH4.5左右来加工左右来加工. .n二巯基丙醇二巯基丙醇, ,亚硫酸钠亚硫酸钠, ,半胱氨酸半胱氨酸, ,抗坏血酸抗坏血酸对对PPOPPO活性具有强烈的抑制作用活性具有强烈的抑制作用, ,能有效地防止能有效地防止PPOPPO褐变褐变引起的质量问题引起的质量问题n文献报道一种没有文献报道一种没有PPOPPO活性的马铃薯已通过遗传活性的马铃薯已通过遗传工程的方法得到工程的方法得到