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1、多酚氧化酶（多酚氧化酶（PPO）的制备、鉴）的制备、鉴定、性质及应用定、性质及应用 石松山石松山 化学生物学实验outlinen n简介多酚氧化酶n n实验部分 PPOPPO粗酶制剂的制备粗酶制剂的制备 柱层析提纯柱层析提纯 PPO PPO的性质及应用的性质及应用 n n注意事项简介n n多酚氧化酶多酚氧化酶(polyphenol oxidase(polyphenol oxidase，简称，简称PPOPPO）氧化还原酶氧化还原酶 金属蛋白酶金属蛋白酶 广义上，广义上，PPOPPO可分为单酚氧化酶、双酚氧化酶、漆酶可分为单酚氧化酶、双酚氧化酶、漆酶植物在植物组织中，PPO是与内囊体M膜结合在一起
2、的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后被活化，从而表现出活性。n n马铃薯块茎中几乎所有的亚马铃薯块茎中几乎所有的亚马铃薯块茎中几乎所有的亚马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有细胞部分都含有细胞部分都含有细胞部分都含有PPO,PPO,。n n在在在在PPOPPO中，铜中，铜中，铜中，铜是酶的是酶的活性中活性中活性中活性中心心心心，从蛋白质中除去一部分，从蛋白质中除去一部分或全部铜，将引起酶活性下或全部铜，将引起酶活性下降或完全失活，若添加铜的降或完全失活，若添加铜的话，酶活又能恢复。不同果话，酶活又能恢复。不同果蔬中的蔬中的PPOPPO铜辅基的数量会有铜辅基的数量会有所不同，如蘑菇中所不同
3、，如蘑菇中PPOPPO含含4 4个个铜原子，而扁豆的铜原子，而扁豆的PPOPPO含含1 1个个铜原子。铜原子。研究研究研究研究PPOPPO的意义的意义的意义的意义n n现在现在PPOPPO的应用多用于提高植物对的应用多用于提高植物对病原菌的抗性病原菌的抗性病原菌的抗性病原菌的抗性。如，。如，黄瓜对黑星病的抗性、水稻对白叶枯病的抗性等黄瓜对黑星病的抗性、水稻对白叶枯病的抗性等n nPPOPPO与一些水果和作物的褐化有关。与一些水果和作物的褐化有关。PPOPPO催化多酚氧催化多酚氧化为醌，醌聚合并与细胞内大白纸的氨基酸反应，结化为醌，醌聚合并与细胞内大白纸的氨基酸反应，结果产生很色素沉淀。果产生很
4、色素沉淀。n nPPOPPO是决定红茶品质的关键酶类。在啤酒生产过中是决定红茶品质的关键酶类。在啤酒生产过中,PPO,PPO与啤酒风味陈化紧密相关。反之与啤酒风味陈化紧密相关。反之,为了防止水果为了防止水果褐化褐化,保持水果新鲜保持水果新鲜,生产上也运用多种方法降低水果生产上也运用多种方法降低水果中中PPOPPO活性和含量。活性和含量。实验部分PPOPPO的制备的制备1.1.制备马铃薯丙酮粉制备马铃薯丙酮粉 取取50g50g去皮切丁的马铃薯去皮切丁的马铃薯 与与60mL60mL丙酮（丙酮（-20-20）混）混合合 粉碎粉碎 抽滤抽滤 滤渣用滤渣用-20-20 的丙酮冲的丙酮冲洗至白色洗至白色
5、室温下晾干。室温下晾干。2.PPO2.PPO粗提液的制备粗提液的制备 5g 5g马铃薯干粉马铃薯干粉 与与40mL40mL粗酶提取液混合粗酶提取液混合 搅拌搅拌1min 1min 静止静止1hr1hr，4 4 离心（离心（4 4，15000rpm15000rpm，15min15min）过滤取上清，即得过滤取上清，即得PPOPPO粗提液粗提液 粗酶提取液为粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB4.2g+1000mL0.2M PBPPOPPO纯化之盐析纯化之盐析1.1.盐析原理盐析原理 PPOPPO的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在的纯化常采用盐析法。盐析主要是利用酶蛋白在高浓度
6、的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸高浓度的盐溶液中溶解度减小而析出的原理。硫酸按由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定，故是按由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定，故是最常用的盐析剂。最常用的盐析剂。2.2.实验步骤实验步骤 粗酶制剂加入等体积饱和粗酶制剂加入等体积饱和(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4 静置静置1hr1hr，4 4 离心离心 （4 4，17000rpm17000rpm，10min10min）收集沉收集沉淀淀 加加15mL0.2MPB15mL0.2MPB溶解溶解 再次离心（条件再次离心（条件同前）同前）收集上清，即得收集上清，即得PPOPPO粗酶制剂粗酶制剂 取取4mL
7、4mL粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得粗酶制剂于冷冻干燥机上冻干，得PPOPPO干粉。干粉。PPOPPO纯化之柱层析纯化之柱层析1.1.文献报道植物组织中文献报道植物组织中PPOPPO分子量一般介于分子量一般介于40-70K40-70K之间，之间，SephdexSephdex(葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶)具有分子筛效应，一定型号的具有具有分子筛效应，一定型号的具有一定的孔径。一定的孔径。2.2.柱子是不是愈长愈好？作用是什么？柱子是不是愈长愈好？作用是什么？3.3.装柱和上样适应注意什么？装柱和上样适应注意什么？层析系统层析系统装柱装柱 平衡平衡平衡平衡 加样加样加样加样 洗脱洗脱洗脱洗脱 收集收集收
8、集收集恒流泵恒流泵部分收集器部分收集器梯度混合仪梯度混合仪层析柱层析柱分离原理分离原理 在用在用SephadexSephadex进行凝胶层进行凝胶层析实验时常使用一定浓度析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液。的盐溶液作为洗脱液。PPOPPO性质（略，周四）性质（略，周四）PPO PPO定性鉴别定性鉴别 PPO PPO 化学性质化学性质 PPO PPO底物专一性（邻苯二酚，对苯二酚，间苯二酚）底物专一性（邻苯二酚，对苯二酚，间苯二酚）底物浓度底物浓度 酶浓度酶浓度 pH pH的影响的影响(活性最强在活性最强在6.8-7.2)6.8-7.2)详见教材详见教材PPOPPO抑制剂及其应用抑制剂及其
9、应用 金属离子的影响（二价离子，金属离子的影响（二价离子，Zn2+Zn2+等）等）二价铜离子及铜铁试剂的影响二价铜离子及铜铁试剂的影响 某些有机溶剂的影响某些有机溶剂的影响 其他抑制剂（其他抑制剂（NaSO3NaSO3、VcVc）的影响）的影响苹果的保险实验苹果的保险实验详见教材详见教材注意事项n n高速组织捣碎机的使用高速组织捣碎机的使用 先慢后快先慢后快n n干粉应抽滤至白色干粉应抽滤至白色n nPPOPPO粗提液应接近无色粗提液应接近无色n n盐析时硫酸铵不宜过多或过少盐析时硫酸铵不宜过多或过少n nPPOPPO粗酶制剂定性鉴别前，先测活性。粗酶制剂定性鉴别前，先测活性。n n0.01M0.01M邻苯二酚需现配，本次用量极少邻苯二酚需现配，本次用量极少 （避免接触光照和（避免接触光照和空气）空气）