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1、lDNA是染色体的组成成分，遗传的物质基础l研究遗传、疾病发生的基础l研究的前提：DNA的提取第一部分：第一部分：DNA提取提取l 目前，提取基因组DNA的方法不仅成熟而且有多种方法可供选择，如经典的酚氯仿抽提法、不同试剂公司开发的各种DNA提取试剂盒、Chelex-100法等。l 具体选择何种方法要根据提取DNA所用材料的来源及特点、材料的多少、所需DNA的质量要求、提取效率等诸多因素，综合考虑最终选择适合自己或者实验室条件的方法。1.1.材料准备材料准备2.2.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放3.3.核酸分离、纯化核酸分离、纯化4.4.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核
2、酸，并去除杂质 5.5.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中l 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融l 提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）时，要选择有核细胞（白细胞）l 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解降解l 含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，提取前先富集含量较少，提取前先富集二、二、DNA提取注意事项提取注意事项l 适量。细胞过多会影响裂解，导致适量。细胞过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低量少，纯度低l 匀浆时应保持
3、低温匀浆时应保持低温(冰浴中冰浴中)，匀浆时间应短，匀浆时间应短(30s次，次，2次）次）l 针对不同材料，选择适当的针对不同材料，选择适当的裂解预处理裂解预处理 方式：方式： 植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠l 高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡3. 核酸分离、纯化：l 采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。l 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。离心分离两相时，应保
4、证一定的转速和时间。l 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。方法。蛋白质的去除：蛋白质的去除：l酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提l使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）l高盐洗涤高盐洗涤l蛋白酶处理蛋白酶处理多糖的去除：多糖的去除：l 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。l 用用 多糖水解酶多糖水解酶 将多糖降解。将多糖降解。l 在提取缓冲液中加一定量的在提取缓冲液中加一定量的
5、氯苯氯苯 (1/2, v/v)(1/2, v/v)，氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。l 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。多酚的去除：多酚的去除：l 在抽提液中加入在抽提液中加入 防止酚类氧化防止酚类氧化 的试剂：的试剂：-巯基乙醇巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫
6、苏糖醇等l 加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合盐离子的去除：盐离子的去除：l 7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤4. 核酸沉淀、溶解l 当沉淀时间有限时，用当沉淀时间有限时，用预冷的预冷的 乙醇或异丙醇沉淀，沉淀乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。会更充分。l 沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充），有利于充分沉淀。分沉淀。l 沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等。的乙醇洗涤，
7、以除去盐离子等。l 晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。l 若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。缓冲液溶解。l TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase。l pH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 。附经典的经典的酚氯仿抽提法l 基本过程是在基本过程是在EDTA及及SDS一类的去污剂及蛋白一类的去污剂及蛋白酶酶K等的作用下破碎细胞，消化蛋白质等的作用下破碎细胞，消化蛋白质l 酚、氯仿抽提则可去除与酚、氯仿抽提则可去除与DNA结合的蛋白质以及结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大
8、分子。多糖、脂类等生物大分子。l 然后通过沉淀然后通过沉淀DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，去除盐类、有机溶剂等杂质，达到纯化达到纯化DNA的目的。的目的。l 制备制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持物质分离干净，又要保持DNA分子的完整。分子的完整。 l EDTA可以螯合金属离子，抑制可以螯合金属离子，抑制DNase的活性，防的活性，防止止DNA的降解。的降解。l SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：是离子型表面活性剂，主要作用是：溶解膜溶解膜蛋白而破坏细胞膜；蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；解聚细胞中的核蛋白；与与蛋白
9、质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。l 蛋白酶蛋白酶K，广谱蛋白酶，在广谱蛋白酶，在SDSSDS、EDTAEDTA存在下保持很存在下保持很高的活性，高的活性，可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使DNA分子尽量完整地分离出来。分子尽量完整地分离出来。 各种试剂的作用各种试剂的作用l 酚是一种作用非常强烈的蛋白质变性剂，多在初步纯化过酚是一种作用非常强烈的蛋白质变性剂，多在初步纯化过程中使用，能非常有效地使蛋白质变性而去除。程中使用，能非常有效地使蛋白质变性而去除。l 氯仿也是一种高效的蛋白质变性剂，特别是氯仿有强烈溶氯仿也是一种高效
10、的蛋白质变性剂，特别是氯仿有强烈溶脂性，对于同时去除脂质类杂质很有好处；氯仿能将微量脂性，对于同时去除脂质类杂质很有好处；氯仿能将微量的溶于的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉，否则微量的酚对于后续水溶液中的酚抽提掉，否则微量的酚对于后续的酶切、转化等过程都会产生不利影响；加速有机相与液的酶切、转化等过程都会产生不利影响；加速有机相与液相分层。相分层。l 异戊醇可以减少气泡产生；有助于分相，使离心后的上层异戊醇可以减少气泡产生；有助于分相，使离心后的上层含含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。稳定。l 沉淀沉淀DNA可用可用23倍体积的
11、乙醇或使用倍体积的乙醇或使用0.61倍倍体积的异丙酵。沉淀通常在体积的异丙酵。沉淀通常在0或或-20进行，对进行，对于几个于几个kb或更大的或更大的DNA分子而言，分子而言，1530 min的沉淀时间已经足够；对于分子较小的沉淀时间已经足够；对于分子较小(200bp)或或浓度较低浓度较低(10ng)的酶切片段，增加时间会明显的酶切片段，增加时间会明显提高回收率。提高回收率。附实验操作步骤：附实验操作步骤：（1）取）取150-200 l全血，或组织约全血，或组织约0.1g置于置于1.5mL Eppendorf管中，加入管中，加入450 lSTE缓冲液缓冲液(30 mM Tris-HCL,200
12、mM EDTA,50 mM NaCl,pH 8.0)，如果是组织的话，加入如果是组织的话，加入STE后要用剪刀将组织剪碎，然后加入终浓度分后要用剪刀将组织剪碎，然后加入终浓度分别为别为1的的SDS和和200 g/ml的蛋白酶的蛋白酶K。（2）充分混匀后置）充分混匀后置56温箱中消化温箱中消化812小时至透明。小时至透明。（3）加入等体积的水饱和酚，缓慢混匀）加入等体积的水饱和酚，缓慢混匀20分钟或于转轮上缓慢转动抽提分钟或于转轮上缓慢转动抽提24小时。小时。（4）9000转转/分离心分离心10分钟，上清液转至另一干净的分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中，加入管中，加入等体积的苯酚
13、等体积的苯酚:氯仿氯仿(1:1)混合液缓慢混匀抽提混合液缓慢混匀抽提20分钟。分钟。（5）9000转转/分离心分离心10分钟，上清液转至另一干净的分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中。再加管中。再加入等体积的氯仿入等体积的氯仿:异戊醇异戊醇(24:1)抽提抽提10分钟分钟（6）9000转转/分离心分离心10分钟。上清液转至另一干净的分钟。上清液转至另一干净的Eppendorf管中，加入管中，加入等体积的异丙醇或预冷的等体积的异丙醇或预冷的2倍体积无水乙醇沉淀倍体积无水乙醇沉淀DNA。（7）12000转转/分离心分离心10分钟后，弃上清，保留分钟后，弃上清，保留DNA沉淀。沉淀。（8
14、）加入）加入800-1000 uL70%乙醇洗涤乙醇洗涤DNA沉淀，沉淀，12000转转/分离心分离心10分钟后，分钟后，弃上清。（弃上清。（9）将）将DNA样品置于真空干燥器干燥样品置于真空干燥器干燥3分钟左右或分钟左右或56温箱烘温箱烘干干3-4小时，加入适量小时，加入适量TE缓冲液（缓冲液（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0）溶解，置溶解，置4备用或保存于备用或保存于20。DNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚类杂质多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有在溶解前，有酒精残留，酒精抑酒精残留，酒精抑制后续酶解反应制后续酶解反应DNA中残留中残留有金属有金属离子离子
15、重新纯化重新纯化DNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂质白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）（具体方法见前）重新沉淀重新沉淀DNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发增加增加70乙醇洗涤的次乙醇洗涤的次数（数（2-3次）次）q问题一：问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应反应。 原原因因对对策策DNA提取常见问题与对策材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染反复冻融反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取
16、新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融。免反复冻融。液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNA时，可增加裂解液中时，可增加裂解液中螯合剂螯合剂的含量。的含量。细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。温灭菌。将将DNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。反复冻融。q问题二：问题二：DNA降解降解。对对策策 原原因因DNA提取常见问题与对策实验材料不佳或量少实验材料不佳或
17、量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）的材料。料。动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增（对于动物细胞、细菌可增加加PK的用量）。的用量）。低温沉淀，延长沉淀时间。低温沉淀，延长沉淀时间。加辅助物，促进沉淀。加辅助物，促进沉淀。洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。液吸出，勿倾倒。DNA提取常见问题与对策q问题三：
18、问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策 原原因因19PCR原原理理变性变性95C左右左右延伸延伸适温适温退火退火Tm-5C第二部分第二部分 PCR技术技术 5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 The mechanism of PCRCycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 By about 30 cycles, DNA fragment is amplified by some million times. 二二 、PCRPCR引物设计引
19、物设计引物引物决定决定PCRPCR扩增产物的扩增产物的特异性和长度。特异性和长度。PCRPCR引物的设计引物的设计与与PCRPCR反应的反应的成败关系密切。成败关系密切。DNADNA是双链分子，是双链分子，设计引物时以一条设计引物时以一条DNADNA单链单链（一般为编码链）为基准（一般为编码链）为基准。tgaggagttcaaggagctgaaggcgcgcaattgaggagttcaaggagctgaaggcgcgcaataccaagaaggagggggatttgttggctgcgcaccaagaaggagggggatttgttggctgcgcaggcccggctcaaggacctggagg
20、ctcttctaggcccggctcaaggacctggaggctcttctcaactccaaggaggctgccctgagcactgctcaactccaaggaggctgccctgagcactgctctcagtgagaaacgcacgttggaaggcgag ctcagtgagaaacgcacgttggaaggcgag 33 部分部分mRNAmRNA序列序列5核苷酸一级结构序列数据库：核苷酸一级结构序列数据库： GenBank数据库数据库 美国国立生物技术信息中心美国国立生物技术信息中心(NCBI) http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/ EMBL数据库数据库 DDBJ数据库
21、数据库LOCUS HUMLAMIN03 6110 bp DNA KEYWORDS alternative splicing; lamin; lamin A; lamin C; 3 of 3source 1.6110mRNA join(L12399:417.772,L12400:45.201,71.196,472.642, exon 71.196 /number=3 exon 472.642 /number=4 exon 854.979 /number=5ORIGIN 1 acctctcagc ttccttcaag ttcttgtgtt ctgtgacccc ttttcctcat ctctgcc
22、tgc 61 ttcctcacag cttgaggcag ccctaggtga ggccaagaag caacttcagg atgagatgct PCR引物设计引物设计引物设计一般所需遵循的基本原则引物设计一般所需遵循的基本原则:*1 1 引物长度引物长度：18182525个核苷酸。上下游引物的长个核苷酸。上下游引物的长度差不能大于度差不能大于3nt3nt。2 2 碱基组成：碱基组成： 四种碱基尽可能四种碱基尽可能随机分布随机分布， 避免碱避免碱基的多聚现象基的多聚现象; ; G GC C含量含量在引物碱基中含量尽可在引物碱基中含量尽可能在能在45455555；配对的两条引物，它们的配对的两条
23、引物，它们的TmTm应尽可能相近应尽可能相近。（相差。（相差5)LOC)CCLOC)等。等。2 2 支持物介质：支持物介质：DNADNA凝胶电泳常使用两种支持材料：凝胶电泳常使用两种支持材料：琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶和和聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶酰胺凝胶. .通过这两种介质的通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小分子筛网孔大小，分离不同分子量的核酸片段。，分离不同分子量的核酸片段。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶的孔径大，可以分离的孔径大，可以分离100bp100bp60kb60kb的的DNADNA分子分子聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片段的孔径小，可分离小片
24、段5 5500bp.500bp.电场强度电场强度 电泳场电泳场两极间单位支持物长度的电压降两极间单位支持物长度的电压降称电场强度称电场强度或电压梯度。或电压梯度。 电场强度愈大电场强度愈大，带电颗粒的，带电颗粒的泳动速率愈快泳动速率愈快，但凝胶的，但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小有效分离范围随电压的增大而减小。 一般凝胶电泳的电场强度不超过一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm5V/cm, ,对于大分子量对于大分子量真核基因组真核基因组DNADNA片段的电泳常采用片段的电泳常采用0.50.51.0V/cm1.0V/cm电泳电泳过夜，以取得较好的分辨率和带型。过夜，以取得较好的分辨率和带型
25、。4 4 缓冲液缓冲液 缓冲液是电泳场中的导体，它的缓冲液是电泳场中的导体，它的种类、种类、pHpH值、离子值、离子强度强度直接影响电泳的速率。电泳缓冲液常使用直接影响电泳的速率。电泳缓冲液常使用TAETAE、TBETBE缓冲体系缓冲体系。 缓冲液的缓冲液的pHpH值直接影响值直接影响DNADNA的带电性质及带电量的的带电性质及带电量的多寡。多寡。DNADNA电泳缓冲液，常采用电泳缓冲液，常采用偏碱性或中性条件偏碱性或中性条件，使核酸分子使核酸分子带负电荷，向正极移动带负电荷，向正极移动。 缓冲液的缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最，电泳的最适离子强度一
26、般在适离子强度一般在0.020.020.20.2之间。之间。电泳指示剂电泳指示剂：电泳过程中，常使用一种电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物有颜色的标记物以以指示样品的迁移指示样品的迁移过过程。程。常用的指示剂常用的指示剂溴芬兰溴芬兰呈篮紫色（常用于琼脂糖凝胶电泳）呈篮紫色（常用于琼脂糖凝胶电泳）二甲苯青二甲苯青呈蓝色呈蓝色（常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳）（常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳） 为了为了使样品能沉入胶孔使样品能沉入胶孔，还要加入适当的蔗糖、聚蔗糖，还要加入适当的蔗糖、聚蔗糖400 或甘油以增加比重。或甘油以增加比重。染色剂染色剂：核酸需经染色才能显示出带型，最常用的是核酸需经染色才能显示出带
27、型，最常用的是溴化乙锭溴化乙锭（ethidium bromide, EBethidium bromide, EB）染色法。溴乙锭是一种荧光）染色法。溴乙锭是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光紫外线激发下，发出桔红色荧光。EBEBDNADNA复复合物中的合物中的EBEB发出的荧光，比游离在凝胶中的发出的荧光，比游离在凝胶中的EBEB本身发本身发出的荧光强度大出的荧光强度大1010倍。因此不需洗净背景。倍。因此不需洗净背景。 EBEB见光易分解，应存见光易分解，应存棕色瓶中在棕色瓶中在44下保存。下保存。结束结束