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1、第 卷第 期 年 月 蛋白质含量测定方法的比较 郭 颖娜 ， 孙 （ 华北制药股份有限公司，河北 卫 石家庄 ） 摘 要 蛋白质与生命的起源、存在和进化都密切相关，蛋白质含量测定涉及到生产和科研的众多领域。目前常用的方法有 凯氏定氮法、双缩脲法（）、紫外吸收法、考马斯亮蓝法 ）。本文总结各种方法的特点及适用条件，针对不同的待测 样品以及对测定结果准确性的要求不同，我们可以采用不同的方法来测定样品中蛋白质的含量。 关键词 蛋 白质；凯氏定氮法；双缩脲法；紫外吸收法；考马斯亮蓝法 中图分类号 文献标识码 文章编号 （） 蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常 ；与其他硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸用量方
2、法对 用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮 比，该法所需消化时间最短，试剂用量减少，可降低实 法、双缩脲法（）、紫外吸收法、考马斯亮蓝法 验成 本，也降低了对环境的污染。 （ ）。其中 法灵敏度最高，比紫外 凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确，重现 吸收法灵敏 倍，比 法灵敏 倍以 性好，但操作复杂费时，试剂消耗量大。若采用模块式 上。 凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定 消化炉代替传统的消化装置， 可同时测定几份样品， 氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。这 节省时间，提高了工作效率，适用于批量蛋白质的测 种方法并不能在任何条 件下适用于任何形式的蛋白 定，具有准确
3、、快速、简便、低耗、稳定的优点。 质，每种方法都有其优缺点，在选择方法时应考虑： 双缩脲法 （ ） 实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性 原理 质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时 双缩脲（ ）是两个分子脲经 间。 左右加热，放出 个分子氨后得到的产物。在 强碱性 凯 氏定氮法 溶液中，双缩脲与 形成紫色络合物，称为双缩 原理 脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键， 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸 或能够以 个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都 收和滴定 个过程。其原理是样品中含氮有机化合物 有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度 与浓硫酸在催化剂作用
4、下共热消化，含氮有机物分解 成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可 产生氨，氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。然后加碱蒸馏 用来测定蛋白质含量。 放出氨， 氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶 特点 液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性 特点 有显著影响， 采用 样品， 双缩脲试剂的 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用 比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质 的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方 产生颜色的深浅相近，不受温度的影响。可快速测定 法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。凯氏 蛋白质含量，试剂单一，方法简便，但灵
5、敏度差，测定 定氮法样品的最佳消化条件为硫酸铜 ， 硫酸 范围为 蛋白质。适用于需要快速，但并不需 钾 ，浓硫酸 ；硫酸铜的用量为影响消 要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基 白质含量测定。 化时间的主要因素，硫酸钾和浓硫酸用量为第二和第 紫外吸收 法 三主要因素；用此最佳条件做实验， 消化时间仅为 原理 收稿日期 作者简介 郭颖娜（），女，助理工程师，从事质检工作。 的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性 第 期 郭颖娜 孙 卫：蛋白质含量测定方法的比较 质，吸收峰在 处，其吸光度（即光密度值）与蛋 白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在 的光吸
6、 特点 考马斯亮蓝 与蛋白质结合反应十分迅速 收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶 液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋 白质含量的测定。 特点 最常用的紫外吸收法是 的光吸收法，含 有核酸的蛋白质溶液使用 和 的吸收差法 较好。蛋白质的稀溶液采用 与 的吸收差 法。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度 盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于 柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋 白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 缺点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质 较多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与 标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的
7、蛋白质 有一 定的误差，故该法适于用测定与标准蛋白质氨基 酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核 酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸在 紫外区也有强吸收，但通过校正可以消除。但是因为 不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经 过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行 紫外吸收法测定时， 由于蛋白质吸收高峰常因 的 改变而有变化，因此要注意溶液的 值，测定样品时 的 要与测定标准曲线的 相一致。 考 马斯亮蓝法（ ） 原理 法是根据蛋白质与染料相结合的原理 设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下 呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸 特别 是精氨酸）
8、和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其 最大吸收波长从 变为 ， 蛋白质在 范围内， 蛋白质色素结合物在 波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白 质的定量测定。 而稳定， 左右即达到平衡，其结合物室温下 内保持稳定，且在 之间，颜色的稳定性最 好。该法方法简便，易于操作，所用试剂较少，显色剂 易于配制。干扰物质少，如糖、缓冲液、还原剂和络合 剂等均不影响显色。此法的缺点是由于各种蛋白质中 的 精 氨 酸 和 芳 香 族 氨 基 酸 的 含 量 不 同 ， 因 此 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 球蛋白为标准蛋白 质，以减少这方面的偏差。标准曲线也有轻微的非
9、线 性，因而不能用 定律进行计算，而只能用标准曲 线来测定未知蛋白质的浓度。该方法适用于要求灵敏 度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。 结 语 种蛋白质测定方法比较如表 所示。 表 蛋白质测定方法的比较 方法 灵敏度 时间 原理 说明 凯氏定 灵敏度低，适用于 费时，将 蛋白质转化为氮， 用于标准蛋白质含 扰少；费时太长。 多肽键 碱性 脲法 白质显色相似。 和色氨酸残基在 液的检测；核酸的 收法 处的光吸收。 吸收可以校正。 少；颜色稳定；颜色深浅 随蛋白质不同而变化。 参 考 文 献 李 宁 几种蛋白质测定方法的比较 山西 农业大学学报， ，）： 李存富关于蛋白质测定中几 个问题的理论分析与讨论中国酿 造，（，）： 孙建平，侯彩云稻米蛋白质测定方法的比较与分析食品科技， ， 张龙翔，张庭芳，李令媛，等生化实验方法和技术北京： 高等教 育出版社， 刘玉兰，刘 坤，李 珊食品中蛋白质含量测定方法的改进和应用 青岛医学院学报， 河 北 化 工 欢 迎 投 稿 编辑部邮箱： 稿件情况咨询电话： 量的准确测定；干 用酸吸收后滴定。 用于快速测定，但 不太灵敏；不同蛋 蛋白质中的酪 氨酸 紫外吸 较为灵敏， 快速， 考马斯亮蓝染料与蛋 考马斯 灵敏度最高， 快速， 白质结合时， 由 变为 。