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1、DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定构成生物体的遗传物质是什么？构成生物体的遗传物质是什么？讨论：讨论：构成生物体的遗传物质是什么？构成生物体的遗传物质是什么？怎样才能将细胞内的遗传物质分怎样才能将细胞内的遗传物质分离出来？离出来？ 讨论讨论2 2：讨论：讨论：基础知识基础知识基础知识基础知识1. 1. 提取提取DNA的基本思路的基本思路利用利用DNA与与RNA、蛋白质和脂质、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提等在物理和化学性质方面的差异，提取取DNA，去除其他成分。，去除其他成分。2. DNA的溶解性的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓和蛋白质等其他成分在不同浓度的度的NaCl溶
2、液中溶解度不同，利用这一溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。分溶解，而使杂质沉淀，或者相反。根据根据DNA在在NaCl溶液中的溶解度曲溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度的溶解度最小？最小？ DNA在在NaCl溶液中的溶解度是如何溶液中的溶解度是如何变化的？变化的？根据根据DNA在在NaCl溶液中的溶解度曲溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度的溶解度最小？最小？ DNA在在NaCl溶液中的溶解度是如何溶液中的溶解度是如何变化
3、的？变化的？在在NaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 mol/L时，时，DNA的溶解度随的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而溶液浓度的增加而逐渐降低逐渐降低; 在在0.14 mol/L时，时，DNA溶解度最小；溶解度最小；当当NaCl溶液浓度继续增溶液浓度继续增加时，加时，DNA的溶解度又的溶解度又逐渐增大。逐渐增大。如何通过控制如何通过控制NaCl溶液的浓度使溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？在盐溶液中溶解或析出？0溶解度溶解度NaCl浓度浓度0.14mol/L2mol/L如何通过控制如何通过控制NaCl溶液的浓度使溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？在盐溶液中溶解或析出？当氯化
4、钠的物质当氯化钠的物质的量浓度为的量浓度为 2 molL时，时，DNA的溶解度最的溶解度最大，浓度为大，浓度为 0.14 molL时，时，DNA的溶解的溶解度最低。利用这一原度最低。利用这一原理，可以使理，可以使DNA在盐在盐溶液中溶解或析出。溶液中溶解或析出。3. DNA在酒精溶液中的溶解性在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以将原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离。与蛋白质进一步分离。4. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性4. DNA对酶、高温和洗
5、涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，蛋白酶能水解蛋白质，但是对但是对DNA没有影响没有影响4. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，蛋白酶能水解蛋白质，但是对但是对DNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而的高温，而DNA在在80以上才会变性以上才会变性4. DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，蛋白酶能水解蛋白质，但是对但是对DNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而的高温，而DNA在在80以上才会变性以上才会变性
6、洗涤剂可以溶解细胞的洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白细胞膜，去除脂质和蛋白质质,但对但对DNA没有影响没有影响5. DNA的鉴定的鉴定5. DNA的鉴定的鉴定DNA与二苯胺（沸与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，水浴）会染成蓝色，因此，二笨胺可以作因此，二笨胺可以作为鉴定为鉴定DNA的试剂。的试剂。5. DNA的鉴定的鉴定DNA与二苯胺（沸与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，水浴）会染成蓝色，因此，二笨胺可以作因此，二笨胺可以作为鉴定为鉴定DNA的试剂。的试剂。甲基绿（蓝绿色）甲基绿（蓝绿色）通过利用不同浓度通过利用不同浓度NaCl溶液溶解溶液溶解或析出或析出DNA，可以从细胞中提取和提，可以从
7、细胞中提取和提纯纯DNA；再利用酒精进一步将；再利用酒精进一步将DNA与与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是是否是DNA。原理总结原理总结（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取实验设计实验设计1.材料：材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体中培养基的培养的豌豆、菠菜、在液体中培养基的培养的大肠杆菌。（从中选取大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）种实验材料）2.原则：原则：凡是含有凡是含
8、有DNA的生物材料都可的生物材料都可以考虑，但选用以考虑，但选用DNA含量相对较高的生含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。物组织，成功的可能性更大。（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液的滤液1.1.动物细胞动物细胞动物细胞的破碎较易，例如，在动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。即可。讨论讨论为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论讨论为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对
9、于鸡血细胞来说是一答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。植物细胞需要先用一定的洗涤剂植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜和食盐溶解细胞膜2. 2. 植物细胞植物细胞讨论讨论加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？讨论讨论加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些
10、离子去污剂，答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；的释放；食盐的主要成分是食盐的主要成分是NaCl，有利于，有利于DNA的溶解。的溶解。植物细胞需要先用一定的洗涤剂植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜和食盐溶解细胞膜2. 2. 植物细胞植物细胞实例：实例：提取菜花提取菜花DNA时，在切碎的菜花时，在切碎的菜花中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液.(洋葱也行洋葱也行)讨论讨论如果研磨不充分，会对实验结果产如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？生怎样
11、的影响？讨论讨论如果研磨不充分，会对实验结果产如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的释放不完全，提取的DNA量变少，量变少，影响实验结果，导致看不到丝状淀淀影响实验结果，导致看不到丝状淀淀物、用二笨胺鉴定不显示蓝色等。物、用二笨胺鉴定不显示蓝色等。（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的为了纯化提取的DNA需要将滤液需要将滤液作进一步处理。作进一步处理。（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质为了纯化提取的为了纯化提取的DNA需要将滤液需要将滤液作进一步处理。作进一步处理。
12、讨论讨论此步骤获得的滤液中可能含有哪此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？些细胞成分？（三）去除滤液中的杂质（三）去除滤液中的杂质答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质等杂质为了纯化提取的为了纯化提取的DNA需要将滤液需要将滤液作进一步处理。作进一步处理。讨论讨论此步骤获得的滤液中可能含有哪此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？些细胞成分？利用利用DNA在不同浓度的在不同浓度的NaCl溶液中溶液中溶解度的不同，通过控制溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓溶液的浓度去除杂质。度去除杂质。具体做法是：在滤液中加入具体做法是：在滤液中加入NaCl，使使NaCl溶液浓度
13、为溶液浓度为2molL，过滤除去不，过滤除去不溶的杂质，再调节溶的杂质，再调节NaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14mol/L，析出，析出DNA，过滤去除溶液中，过滤去除溶液中的杂质，再用的杂质，再用2mol/L溶液溶解溶液溶解DNA。方案一方案一讨论讨论为什么反复地溶解与析出为什么反复地溶解与析出DNA，能，能够去除杂质？够去除杂质？讨论讨论为什么反复地溶解与析出为什么反复地溶解与析出DNA，能，能够去除杂质？够去除杂质？ 答：用高盐浓度的溶液溶解答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去高盐中不能溶解的杂质；用低盐能除去高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶析出，
14、能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出出DNA，就能够除去与，就能够除去与DNA溶解度不同溶解度不同的多种杂质。的多种杂质。方案二方案二直接在滤液中加入嫩肉粉直接在滤液中加入嫩肉粉(图图53)，反应反应1015min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。能够分解蛋白质。将滤液放在将滤液放在6075的恒温水浴箱中的恒温水浴箱中保温保温1015min，注意严格控制温度范围。，注意严格控制温度范围。方案三方案三讨论讨论方案二与方案三的原理有什么不同？方案二与方案三的原理有什么不同？讨论讨论方案二与方案三的原理有什么不同？方案二与
15、方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提分解杂质蛋白，从而使提取的取的DNA与蛋白蛋分开；与蛋白蛋分开；方案三利用的是方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，不同，从而使蛋白质变性，与与DNA分离。分离。（四）（四） DNA的析出与鉴定的析出与鉴定1. DNA的析出的析出（四）（四） DNA的析出与鉴定的析出与鉴定1. DNA的析出的析出DNA的析出用的是与滤液的析出用的是与滤液体积相等的体积相等的冷却的酒精溶冷却的酒精溶液液(体积分数是体积分数是95%)，静置，静置23min，溶液中会出现，溶液
16、中会出现白白色丝状物色丝状物，这就是粗提取，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿。用玻璃棒沿一个方一个方向向搅拌，卷起丝状物，并搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。用滤纸吸取上面的水。2. DNA的析鉴定的析鉴定鉴定鉴定DNA在试管中先加入物质的量在试管中先加入物质的量的浓度为的浓度为2mol/L的的NaCl溶液溶液5ml于两只于两只试管中，其中一只加入试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二丝状物，各加入二笨胺笨胺4ml试剂。混合均匀试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加后，将试管置于沸水中加热热5min，待试管冷却后，待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解
17、有的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色。的溶液是否有蓝色。3. 实验操作实验操作制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，加柠檬酸钠，静置或离心静置或离心破碎细胞，释放破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌一方向快速通方向搅拌过滤，除去细胞过滤，除去细胞壁、细胞膜等壁、细胞膜等溶解核内溶解核内DNA 加入加入NaCl至至2mol/L，同一方向缓慢搅拌，同一方向缓慢搅拌DNA析出析出加蒸馏水至加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到过滤，在溶解到2mol/L溶液中溶液中除去细胞质中除去细胞质中的大部分物质的大部分物质DNA初步纯化初步纯化 与等体积与等体积95冷
18、冷却酒精混合，析出白色丝状物却酒精混合，析出白色丝状物除去核蛋白、除去核蛋白、RNA、多糖等、多糖等DNA鉴定鉴定 二苯胺，沸水二苯胺，沸水浴，呈现蓝色浴，呈现蓝色操作提示操作提示二笨胺试剂的配制二笨胺试剂的配制称取称取1.5g二笨胺，溶于二笨胺，溶于100ml冰冰醋酸中，再加入醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶的上述溶液中再加入液中再加入0.1ml体积分数为体积分数为0.2%的的乙醛溶液。乙醛溶液。1、以血液为实验材料时，每、以血液为实验材料时，每100ml血液血液中需要加入中需要加入3g柠檬酸钠，防血液凝固。柠檬酸钠，防
19、血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，分子的断裂，导致导致DNA分子不能成絮状沉淀。分子不能成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。鉴定的效果。课题延伸课题延伸本课题使用的洗涤剂是多组分的混本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的实验室提取高纯度的DNA时，通常使用时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷、十二烷基硫酸钠基硫酸钠(SDS)或吐温等化学试剂。或吐温等化学试剂。