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1、 J Jinzhou M ed College 2004 Dec , 25( 6) 43 利用软件 P r im er Pr em ier 5 0 进行 P CR 引 物设计的研究 任 亮 , 朱宝芹 , 张轶博 , 王海燕 , 李尘远 , 苏玉虹 , 巴彩凤 ( 锦州医学院辽宁省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室 , 辽宁 锦州 121001) ! 摘要 目的 运用 Pr imer Premier 5 0 软件设计 PCR 引物 , 并且检验所设计引物的 P CR 扩增效率和特异 性。 方 法 运用 Primer Pr emier 5 0 软件设计 16 对猪和犬的 PCR 扩增引物 ,
2、 通过 PCR 扩增后进行 琼脂糖凝胶电泳检 测 实验结果 。 结果 在所 设计的 16 对引物中有 8 对 P CR 扩增 特异性 好且效率 高 , 成功 率 50% 。但 是 , 其中早 期 设计 引物 12 对只有 4 对成功 , 后期设计引物 4 对全部成功。 结论 从引物设 计的过程中 可以看到 一种趋势 - 后 期引物设计的成功率远远高于早期。这表明我们在引 物设计 方面正在 逐步成 熟 , 的原理在分离新基因的引物设计方面积累了较多的经验。 ! 关键词 PCR 引物设计 ; 软件 P rimer Premier 5 0; P CR 特别 是运用比 较基因 组学定 位 ! 中图分类
3、号 Q 524 ! 文献标识码 A !文章编号 1000- 5161( 2004) 06- 0043- 04 T he Research o f A pply ing Primer P rem ier 5 0 to Desig n PCR Primer REN Liang, ZHU Bao- qin, ZHA N G Y i- bo, WAN G Hai- yan, L I Chen- yuan, SU Yu- hong, BA Cai- feng ( K ey L aborat ory of Molecular Cell Biolog y and N ew Drug of Liaoning
4、P rovince, Jinzhou Medical College, Jinzhou 121001 China) !Abstract Objective With t he help of Primer Premier 5 0 to design PCR primer and verifying t he eff iciency and speciality of PCR about t hese primers Methods Sixt een pairs of primers t hat w ould be amplified in Genomics of pig and dog w e
5、re designed by Primer Premier 5 0 T he result s of PCR w ould be invest ig at ed through agarose g el electrophoresis Results Eight pairs of primers in all designed suc ceeded in t he eff iciency and specialit y of PCR , the ratio of success w as 50 percent T he tw elve pairs of primers w hat were d
6、esigned in t he forepart of the ex periment were only four to amplify bet ter How ever, the four pairs of primers desig ned in the anaphase all succeeded Conclusions T here is a t rend that can be recognized in the process of designing primer N amely, t he forepart is far more t han t he anaphase in
7、 the rat io of success to desig n primer It is indicated t hat our technolog y to design primer is furt her professional Moreover, t he most important is that the t echnique rout e of using t he com para t ive g enom ics to isolate new gene is fart her comprehended and perf ect ed and placing a dire
8、ct ion at next experiment !Key words desig n primer; Primer Prem ier 5 0; PCR 自从 1985 年美国 PE- Cetus 公司的人类遗传 反应 ( polym erase chain react ion; PCR ) 以来 , PCR 研究室 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链 已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技 基金项目 辽宁省科技厅博士启动基金 ( 20021072) !作者简介 任亮 ( 1978- ) , 男 , 辽宁省葫芦岛市人 , 在读硕士研究生 , 主要研究方向为分子生物学。 锦州
9、医学院学报 44 锦州医学院学报 2004 年 12 月 , 25 ( 6) 术手段之一。然而找到一对合适的核苷酸片段作为 引物 , 使其有效地扩增模板 DNA 序列 , 无疑决定 着 PCR 的成败。 Primer Prem ier 5 0 作为当今引物 设计的主流软件 , 有着操作简便、功能强大、成功 率高等诸多优点。本文结合多位研究者的实验结果 对运用 Prim er P remier 5 0 软件设计引物的经验和 教训进行探讨。 1 材料和方法 1 1 实验材料及软件 实验用通城纯种猪基因组 DN A 由华中农业大 学农业部猪遗传育种重点实验室提供。实验用比格 犬基因组 DN A 由军
10、事医学科学院动物实验中心提 供。 PCR 引物设计软件 Prim er Premier 5 0 可以在 w ww bio- sof t net 下载。 1 2 P CR 引物的设计 1 2 1 模板的选择 进行引物设计时模板选择有 两种 情 况。 一 是 扩 增 已 知 基 因 , 这 时 需 要 在 GeneBank 数据库中搜索相同物种该基因的 DN A 或 者 mRN A 为模板来设计引物。另一种是扩增未知 基因 , 这时根据比较基因组定位的原理 , 选择研究 深入的人或哺乳动物 ( 如小鼠 ) 保守的功能基因的 DN A 或者 mRNA 序列为模板来设计引物。 1 2 2 运用 Pri
11、mer Prem ier 5 0 进行引物设计 综 合考 虑引 物设 计 的各 项原 则 , 用 Primer Premier 5 0 软件设计 16 对引物 , 引物序列见表 1。 编 号 模板 引物 序列 (5# 表 1 3# ) 引物的详 细信息 预期产物 预期产物 长度 (bp) 实际长 度 ( bp) 退火温 度 ( % ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 狗 MC4RDNA 狗 MC4RDNA 狗 MC4RDNA 猪 X 基因 mPNA 猪 X 基因 mPNA 人 Y 基因 mRNA 人 Z 基因 DNA 人 Z 基因 DNA 人 Z
12、基因 mRNA 人 Z 基因 mRNA 小鼠 ID4DNA 人 ID4DNA 人 ID4DNA 猪 ID4EST 重叠群 猪 ID4EST 重叠群 猪 ID4EST 重叠群 F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: F: R: CCTAGACT AAAGT TAAGGTGGGA AGGGACTCAGTGGCGTT GC AGGCCACT GAGT CCCT ATGATGAT CCCAACCCG CATCATTT ACT CGGACAG CACCCAGAGGA
13、T AGCA CCTCTACGACTCCGT CAAGC CCCT GGCGATGGTT CTGT ATGTT TGTAAGCTACGAGCA AAT TTATTGAGCAT CTTGTCA TGGGAAGGAGGCTACAAC AGATGAGACAACCGAAGG CATGCTGGT AAGTGTGTC AAGCGTAGATGAGTGGGT GATGAGT GGGT CGATGACG GGACCAGTTT AT CCAGCACA CTCTGGGCAT CGTCAGT C GAGCTTGCAGAT GGAGGC CTCTGGGCAT CGTCAGT C GAT CATGGACTCGAAGAT
14、GT ATCGACT ACAT CCTGGACCT GC T CGCCCTGCTT GTT CACG CGACTACATCCTGGACCTGC CCT GGAACAGCAACCGAACA GGTGTTCGGT TGCT GT TC AGT AGGCTT CTAAAGTCGGATC CTGTGCCT GCAGCGATATG CAGCGGCACAGAAT GCT GTC GCCCACCATCCCGCCCAAC GCGGCTCAGCGGCACAGAAT G GGGCGCGCGCGATGAAGG GGCGGCCGCACACTTGGAAA 狗 MC4RDNA 狗 MC4RDNA 狗 MC4DNA 猪 X
15、 基因 DNA 猪 X 基因 DNA 狗 Y 基因 DNA 狗 Z 基因 DNA 狗 Y 基因 DNA 狗 Y 基因 DNA 狗 Y 基因 DNA 猪 ID4DNA 猪 ID4DNA 猪 ID4DNA 猪 ID4DNA 猪 ID4NA 猪 ID4NA 432 434 419 221 291 左右 439 568 456 266 233 499 518 991 201 153 451 430 左右 430 左右 420 左右 460 左右 52 670 左右 无 无 270 左右 230 左右 无 无 无 无 无 无 55 52 52 55 55 52 52 52 52 57 56 57 55
16、56 56 注 : 1 2 模板名称中的 X、 Y 和 Z 为特定功能基因的代表符号。 表中 4 和 6 的产物实际长度大于预期长度是因为以 mRNA 为模板设计的引物 , 入了内含子。 在以基因组 DNA 为模板扩 增时 , 目的片段间 插 任亮 , 等 利用软件 Primer Premier5 0 进行 PCR 引物设计的研究 45 1 3 PCR 扩增 同 时 在 点 样 孔 中 加 入 100bpMarker 或 者 按照退火温度将 P CR 反应分为 4 组 , 1 组退火 200bpM arker 1, 2 作 为 分 子 量 参 照。 5V / cm 电 泳 温度为 52 % ,
17、 包括 2、 3、 5、 7、 8、 9 和 10 号 ; 2 组退火 60min 。电泳结束后 , 在紫外灯下 观察扩增结 温度为 55 % , 包括 1、 4、 6 和 14 号 ; 3 组退火温度为 56 % , 包 括 12、 15 和 16 号 ; 4 组 退 火 温 度 为 57 % , 包括 11 和 13 号。 P CR 反应体 系 : 基因 组 D NA 100ng , 引 物 20pmol/ L, dN T P10mmol/ L , 果并拍照。 2 结 果 M gCl21 5mmol/ l, T aqDN A 聚 合酶 1U , 加灭 菌 2 1 电泳结果 双蒸水至总体 积
18、 20 l。 PCR 扩增条件 : 94 % 预变 1 组的 2、 3、 5、 9、 10 号和 2 组 的 1、 4、 6 性 3min; 94 % 变 性 1m in, 退 火温 度 见表 1 时 间 号 PCR 扩增效率高、特异性好、电泳结果呈单一 1min, 72 % 延伸 1m in, 1 3 35 个循环 ; 最后 72 % 延伸 亮带 , 引物设计成功。其余各引物无特异性条带或 10min 。 者无条带被 检测到 , 引 物设计失 败 ( 详见表 1) 。 1 4 琼脂糖凝胶电泳检测 从每个扩增管中取出 15 l PCR 扩增产物加入 把 PCR 扩增成功的引物重复检测一次 ,
19、如图 1 和图 2。 照相结果 3 l 上样缓 冲液混匀 , 点样 于 1% 琼脂糖 凝胶上 , 图 1 1、 4、 6 号引物的琼脂糖凝胶电泳 图 2 2、 3、 5、 9、 10 号引物的脂糖凝胶电泳图 注 : 2 2 图 1 左起分别是 1、 4、 6 号引物扩 增结果和 100bpMarker; 图 2 左起分别是 10、 9、 5、 3、 2 号引物扩增结果和 200bpMarker。 结果分析 期设计引物的成功率远高于先期 , 这是我们对实验 在设计的 16 对引物中有 8 对扩增成功 , 总体 结果总结分析、改进引物设计技巧的结果。另一个 成功率 50% 。但是 , 上述 16
20、对引物是先后两个时 是扩增已知基因的成功率远高于扩增未知基因 , 这 期设计完成的。先期我们设计了 12 对引物 , 其中 是扩增已知基 因的难度远低于扩增未 知基因的结 扩增已知基因的 3 对引物是 1、 2 和 3 号 , 全部扩 果。 增 成 功 ; 扩 增 未知 基 因的 9 对 引物 是 6、 7、 8、 11、 12、 13、 14、 15 和 16 号 , 功。后期我们设计了 4 对引物 , 只有 6 号 扩增 成 其中扩增已知基因 3 讨 论 的 2 对引物是 4 和 5 号 , 全部扩增成功 ; 扩增未知 3 1 影响 P rimer Premier 5 0 软件引物设计成功
21、 率 基因的 2 对引物是 9 和 10 号 , 也全部扩增成功。 的因素 另外 , 我们设计的 16 对引物中有 5 对扩增已知基 Primer P remier 5 0 作为当今分子生物学领域 因 , 全部扩增成功 ; 而 11 对扩增未知基因的引物 引物设计的主流软件 , 有着操作简便、功能强大、 只有 3 对成功。虽然我们的样本量还没有达到统计 学要求 , 但是我们从中可以看到两种趋势 : 一是后 所设计的引物扩增成功率高等诸多优点。该软件良 好的引物评价功能和参数设定使设计者不必花费太 46 锦州医学院学报 2004 年 12 月 , 25 ( 6) 多的时间去考虑引物设计的基本原则
22、和注意事项。 断 , 插入的内含子最好不要大于 500bp, 否则很难 但是人为的分析和选择因素也可以影响引物设计的 成功率 , 主要有以下三点 : 第一 , 模板的因素。尽 量避免选择一些困难模板 , 其中有一些模板本身的 GC 含量偏高或偏低 , 导致引物的 GC 含量不能控 制在合适的范围。另外还有一些模板基因家族很大 或者与其 DNA 序列相近的基因很多 , 导致引物的 PCR 扩增不特异。这些最终都造成 PCR 扩增的失 败。例如 , 为了扩增猪 ID4DNA 而设 计的 6 对引 物无一成功就是因为上述因素造成的。第二 , 引物 的筛选。运用 Primer Premier 5 0
23、设计了一组引物 后 , 经过初次筛选得到几对适合要求的引物 , 还要 在初次筛选的基础上进一步筛选出能够进行特异、 高效 PCR 扩增的引物。一是要将得到的一系列引 物分别在 G enebank 中进行回检。也就是把每条引 物 在 比 对 工 具 ht tp: / / w w w ncbi nlm nih gov/ blast/ 的 blast nr 中进行同源性检索 , 弃掉与基因组 其它部分同源性比较高的引物 , 也就是有可能形成 错配的引物。一般连续 10bp 以上的同源有可能形 成比较稳定的错配 , 特别是引物的 3# 端应避免连 续 5- 6bp 的同源。二是如果以 mRNA 为模板
24、设计 引物时还应注意 : 首先利用生物信息学的知识大致 判断外 显子与内含 子的剪 接 位点 ( 例如 htt p: / / CCR - 081 mit edu/ GEN ESCA N html 的 GEN ES CAN 工具或者 GeneParser 软件 ) , 然后弃掉正好位 于剪接位点的引物。第三 , 扩增片段的长度。引物 设计时 预期 产物 的长 度 不要 太长 , DN A 最 好 在 100 到 600bp 之间。而 RN A 最好在 150 到 300bp 之间 , 因为需要考虑待扩增片段间插入内含子的可 能。内 含 子的 大 小 和插 入 位点 可 以 通过 将 模 板 R
25、NA 与该基因其它物种的 DN A 进行比较来大致判 进行高效且特异的扩增。 3 2 用比较基因组学定位的原理分离新基因时引 物设计的注意事项 运用比较基因组学定位的原理分离新基因时引 物设计主要应注意以下两点 : 首先 , 模板的选择。 如果以 DN A 为 模板设 计引 物 , 首 先在 G enebank 中找到与待分离新基因同源的其它物种的该基因。 利 用 ht tp: / / w w w ncbi nlm nih gov/ blast / 的 Blast 工 具 和 ht tp: / / ww w ebi ac uk/ clustalw / 的 Clustalw 工具把已检索到的基
26、因进行同源性比较 , 根据比较基因组定位的原理 , 选择研究深入、标记 稠密的人和哺乳动物 ( 如小鼠 ) 保守 功能基因的 DN A 序列设计引物 , 该引物区段要求在各物种间 绝对保守 , 差异不要 2bp, 特别是 3# 端必需完 全同源。如果以电脑克隆策略获得的待分离物种新 基因的 EST - 重叠群为模板设计引物 , 要求 EST s 与信息探针之间同源性 80% , 长度大于 100bp, 并且避免在 EST 的并接部位和可能的外显子与内 含子剪接位点处设计引物。其次 , 引物序列最好位 于相邻的外显子区 , 且至少距离外显子与内含子剪 接处 25bp 以上 , 这样便于对扩增出来
27、的片段进行 功能鉴定和表型分析。 参 考 文 献 1 黄培堂 , 王嘉玺 , 朱厚咄译 分子克隆实验指南 M 北 京 : 科学出版社 , 2002 385- 701 2 卢圣栋 , 马清钧 , 刘德培 现代分子生物学实验技术 M 北京 : 高 等教育出版社 , 1993 458- 477 3 熊 远著 , 邓昌 彦 , 吴桢 芳 猪 生化 及 分子 遗 传实 验 导 论 M 北京 : 中国农业出版社 , 1999 25- 28 收稿日期 2004- 09- 29 在统计分析中多组计量资料比较为什么不能用 t 检验 对于多组计量资料 , 如果用两均数比较的 t 检验来比较组间的差异 , 会加大犯
28、 I 类错误的概率 2 , 从 而可能把本无差别的两个总体均数判为有差别 。 例如 , 有4 个均数 , 两两组合数为 C4= 6, 若用 t 检验做 6 次比较 , 且每次比较的检验水准为 6 = 0 05, 则每次比较不犯 I 类错误的概率为 ( 1- 0 6 05) , 6 次均不犯 I类错误的概率为 ( 1- 0 05) , 这时 , 总的检验水准变为 1- ( 1- 0 05) = 0 26, 比 0 05 大多了 。 因 此 , 多组均数间的比较不能直接用两均数 t 检验的检验水准和标准误 。 多组均数之间的比较要采用方差分析 ( F 检验 ) , 当方差分析结果为 P 0 05 时 , 只能说明 k 组总体 均数之间不完全相同 。 若想进一步了解哪两组的差别有 统计学意义 , 需进行多个均数间的多重比较 , 即 SN K - q 检验 ( 多个均数两两之间的全面比较 ) 、 L SD- t 检验 ( 适用于一对或几对在专业上有特殊意义的 均数间差别的比较 ) 和 Dunnett 检验 ( 适用于 k- 1 个实验组与一个对比组均数差别的多重比较 ) 。 本刊编辑部