PCR引物设计方法综述.doc

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1、农业 基础 科学 现代 农业 科技 2011 年 第 17 期 摘要 PCR 引物设计方法综述 尤 超 赵 大球 梁 乘榜 周 春华 （ 扬州大学园艺与植物保护学院 ， 江苏扬州 225009） 为 了获 得 PCR 引 物设 计 的理 想方 法 ， 笔 者 运用 NCBI 等 数据 库 与引 物 设 计软 件 Primer Premier 5.0 等 工具 ， 结 合 引 物设 计 的原 则 ， 完成 目的 基因 的引 物设 计 ， 并 对设 计后 的引 物进 行 BLAST 比对 、 综合 评价 和基 因的 重新 检测 等分 析 ， 据 此对 PCR 反应 条件 进 行优 化研 究 。 结

2、果 表明 ， 通过 这些 数据 库和 软件 所设 计的 引物 能基 本满 足后 续的 RT-PCR 反 应 ， 可 以进 行进 一步 的分 子生 物学 研究 。 关键 词 PCR； 引 物设 计 ； 软 件 ； 分 子生 物学 中图 分类 号 S188 文 献 标识码 A 文 章编 号 1007-5739（ 2011） 17-0048-04 Review of the PCR Primer Design Method YOU Chao ZHAO Da-qiu LIANG Cheng-bang ZHOU Chun-hua * （ College of Horticulture and Plant

3、 Protection， Yangzhou University， Yangzhou Jiangsu 225009） Abstract In order to obtain an ideal method of PCR primer design， the author completed primer design of target gene， using some databases and software tools for primer design， such as NCBI， Primer Premier 5.0 and so on， combined with the pri

4、nciple of primer design.Then made a research on optimization of conditions for PCR reaction after the designed primer was analyzed through BLAST comparison， comprehensive evaluation and gene re- test analysis. The results indicated that primers designed through these databases and softwares could ba

5、sically meet the requirements of following RT- PCR reaction and could make an in-depth study of molecular biology.， Key words PCR； primer design； software； molecular biology 聚 合 酶 链 式 反 应 （ Polymerase chain reaction， PCR） 是 20 内 切酶 的 酶 切 位点 5， 有 利 于定 向 克 隆 ， 加 入 的 酶 切 位点 不 世纪 后 期发 展起 来 的一 种体 外 扩增 特异

6、 DNA 片 断的 技术 ， 能 与引 物内 部形 成 互补 结构 6， 并且 所选 择 的 酶 切位 点 尽量 具 有快 速 、 简 便及 高度 敏 感等 优点 ， 能极 大 地缩 短目 的 基因 为 多克 隆 位 点 的中 间 酶 切 位点 ， 最 好 载体 其 他 地 方 无该 酶 扩 增 时 间 。 因 此 ， 其 一 直 是 生 物 学 者 们 致 力 于 构 建 cDNA 文 库 、 基 因 克 隆 以及 表 达 调 控研 究 的 必要 前 提 和 基础 。 近 年 来 ， 该技 术 在相 关领 域 得到 了广 泛应 用 ， 并大 大推 进 了分 后研 究该 基因 的后 续实 验奠

7、 定基 础 。 子生 物学和相关 领域的研究 和发展 。 众所周知 ， 引物设 计是影 通 常情 况 下 ， 研究 者 进 行 引物 设 计 的 基 因 涉 及 到很 多 响 PCR 试 验 的 重要 参 数 之一 。 目 前 ， 虽然 引 物 设 计 软件 的 功 能 都非 常 完 善 ， 但 是 关 于 计算 机 引 物设 计 程 序 的文 献 还 基 因又 包括 多个 基 因 ， 都 必须 综合 分 析 。 以 上便 是研 究 具体 不多 ， 初学 者 具体 操作 起 来还 是会 觉得 比 较复 杂 ， 该 文 拟对 基 因的 目 的 及 意义 ， 即 所 设 计引 物 的 基因 必 须

8、 要 在 相关 领 引物 设计 的原则 和软件 的使 用方法 进行 深入地 探索 和分析 。 域有 自身 的研 究和 应用 价值 。 1 具体 基因 引物 设计 的目 的和 意义 2 引物 设计 总体 概述 在 准备 基 因 引物 设 计 前 ， 要非 常 清 楚 地 了 解 其 研究 的 并 不是 所 有 研究 都 有 可 以借 鉴 的 通 用 基 因 。 由 于 所探 宗 旨和 意义 ， 首先 要查 阅 大量 的文 献 ， 明 确 该基 因的 相 关理 索 的科 学问 题 不同 ， 突破 点和 侧 重点 也就 不 一样 ， 往往 就需 化特 性 。 以 研究 银杏 的顺 式 -异戊 烯 基

9、转 移酶 （ cis-prenyltran 要 根据 不 同 的研 究 目 的 和意 义 进 行 引物 设 计 。 如 研 究植 物 sferase CPT 成 的第 一 个 关 键酶 ， 分 别 从法 尼 基 焦 磷酸 （ Farnesyl pyropho sphate， FPP） 或牦牛 儿基牦 牛 儿基 焦磷 酸 （ Geranylgeranyl pyr- ophosphate， GGPP） 形 成 聚 戊 烯 醇 、 甾 醇 、 类 胡 萝 卜 素 、 叶 绿 CPT Oh 南 芥 中 分 离 和 鉴 定 了 CPT， 而 NCBI 中 尚 无 银 杏 CPT 序 列 的记 载 ， 通

10、过 从 银杏 叶 中 克隆 CPT 进 行 基 因表 达 调 控 和功 能 分 析研 究 ， 对 于探 讨 银 杏 聚戊 烯 醇 的合 成 代 谢 具有 重 要 的 意义 。 其 次 ， 在 进 行 引物 设 计 之 前 必 须 弄 清 楚 是 否 要 进一 步 用于 克隆 或 表达 。 若要 用于 克隆 ， 引物 5端 最好 加 上限 制性 要 涉及 引物 设计 软 件 。 通 过搜 集大 量 的信 息资 源 ， 当 前 进行 厅高校 自然科 学基 金资助 项目 （ 08KJD220002 ）； 扬 州大 学 科技创新培育基金资助项目 （ 2007CXJ018， 2009CXJ030）。 n

11、cbi.nlm.nih.gov）、 DDBJ （ http /www.ddbj.nig.ac.jp： ）、 EMBL http（ ： * 通讯作者 fhcrc.org/blocks/makeblocks.html 或 http： /blocks.fhcrc.org/block 收稿日期 2011-07-04 mkr/makeblocks.html）、 CodeHop（ http： /blocks.fhcrc.org/blocks/ 48 * 1 2 3 的 多倍 化与 杂 交 ， 就 需要 设计 单拷 贝 核基 因的 引 物 ； 而 研究 多 基因 家 族 进化 ， 就 需 要 设计 可 以

12、扩 增这 一 基 因 家族 不 同 7 进行 引物 设计 的主 要数 据库 和生 物软 件 4 目前 ， 进行 引物 设 计时 模板 选 择有 2 种 情 况 ： 一 种 是扩 增 已知 基 因 ， 需 要在 GenBank 数 据 库 中 搜索 相 同 物种 该 基 因的 DNA 或 者 mRNA 作 为模 板 来设 计引 物 ； 另 一 种是 扩增 未 知基 因 ， 需 根据 比较 基 因组 定位 的原 理 ， 选择 研究 深 入的 高 等动 植 物 保 守的 功 能 基 因的 DNA 或 者 mRNA 序 列 为模 8 虽然 引 物设 计模 板 选择 有很 多 ， 但 是无 论 何种 情

13、 况 ， 都 基金项目 江 苏省自 然科学基 金 资助 项目 （ BK2008213）； 江 苏省教 育 引物设 计 的 国 际 三 大 核 酸数 据 库 分 别 为 NCBI（ http： /www. 作者简介 尤超 （ 1987-）， 男 ， 安徽灵璧人 ， 在读硕士研究生 。 研究方向 ： /www.ebi.ac.uk/embl BlockMaker http /blocks. 银杏 次生代谢调控 。 尤 超等 ： PCR 引物 设计 方法 综述 获取序列 （ NCBI， Gramene， EBI 等 ） codehop.htm）、 clustalW2 （ http：/www.ebi.a

14、c.uk/Tools/clustalw2/ index.html）、 VectorNT I Suit、 Dnasis Omiga、 Dnastar、DNAMAN、 Oligo6.0 等 9。 另外 ， 笔者 通 过搜 集资 料发 现 ， 现在 引 物 设计 还 可以直 接登录 http： / 在 SciTools 的 下 拉 菜 单 中 直 接 选 择 PrimerQuest， 然 后 弹 出 相 关 的 操 作 界 面 ， 最后 研 究 者 根据 所 研 究的 目 的 和 意义 进 行 针 对性 的 计 算机 引物 设计 程序 操作 。 设 计引 物 的 软件 一 般 都 具有 引 物 自

15、动 搜 索 功能 ， 不同 软 件 侧重 点 有 所不 同 。 因 此 ， 自动 搜 索 的结 果 也 不 一样 。一 般 以 Premier Primer 5.0 功 能 最 强且 方 便 使用 ， 其 次 是 Oligo 6.0， 其 他 软件 如 Vector NT I Suit、 Dnasis Omiga 和 Dnastar 等 都 带有 引物 自 动搜 索功 能 ， 但 搜索 结 果都 不是 十 分理 想 。当 然 ， 要 想得 到 效果 很好 的 引物 ， 在自 动搜 索 的基 础上 还 要辅 以人 工分 析 。 2.2 设计 原则 虽 然引 物 设 计软 件 种 类 很多 ， 但

16、 其 引 物 设 计 必 须 遵循 以下 基本 原则 。 2.2.1 引 物 与 引 物 之 间 避 免 形 成 稳 定 的 二 聚 体 或 发 夹 结 构 ， 引物 与 模 板 的序 列 要 紧密 互 补 。 引 物 设计 中 ， 特 别需 要 判 断 引物 互 补 配对 情 况 是 否影 响 模 板 与引 物 的 结合 ， 这 需 要估 计模 板与 引物 结合 及引 物配 对结 合 的自 由能 。 A、 T 由 2 个 氢 键连 接 ， G、 C 由 3 个 氢 键 连接 。 一 般 来 说 ， 出 现 3 个 碱 基的 序列 互补 便有 些危 险 ， 尤 其在 引 物 3末 端 。 若

17、3末 端出 现 3 个 碱基 的 序 列互 补 或碱 基 为 GC 的 2 个碱 基 的 序 列互 补 ， 只 好将这 个引 物放 弃 ， 重 新设 计 6。 2.2.2 在 选 择 用 来 扩 增 不 同 物 种 DNA 的 引 物 时 ， 应 避 开 mRNA 的 5和 3末 端非 翻 译 区序 列 。 不同 物 种 mRNA 的 5 和 3末 端 非 翻 译 区 序 列可 能 没 有 任 何 的 同源 性 11， 如 果 选 择 的不 同物 种 DNA 序列 同 源性 非常 低 ， 那么 就 无法 保 证获 得 一 段或 几 段 高度 保 守 的 序列 ， 将 会 为引 物 设 计 带

18、来很 大 的 困扰 ， 特 别 是在 BLAST 比 对 和 Primer Premier 5.0 软 件进 行 评价 分析 时 ， 各 项 参数 指标 将会 远 远达 不到 要求 ， 无 法充 分保 证引物 设计 的高度 敏感 性和特 异性 ， 更 会为 后期 的 RT- PCR 试 验带 来诸 多麻 烦 。 2.2.3 不 同类 型 引 物 设 计 的 特别 原 则 。 特 异 性 引 物 的 错配 率 很 低 ， 甚 至为 零 ， 其中 ， RT-PCR 引 物最 好跨 过 1 个以 上的 内含 子 序列 ； 非特 异性 引 物的 扩增 位点 数 要在 合适 范 围内 ； 简并 性引 物

19、的 简并 性要 合适 等 。 2.3 具体 设计 方法 引物 设计 流程 见图 1。 2.3.1 NCBI 搜 核苷 酸 序 列 。 登 录 www.ncbi.nlm.nih.gov/Gen- Bank， 可以 从 GenBank 中 获取 基 因序 列作 为 模板 。 根据 试验 要求 来 确定 需要 扩 增的 DNA 序 列 ， 并 知 道 其 编 码结 构 基因 区 序列 。 具 体 方法 如下 ： 在 Search 对 话框 中选 择 Nucleotide， 在 对 话框 中 填 入所 要 查 找 的 Nucleotide 名 称 ， 如 输 入 CPT， 点 击 Go 即 得 到 与

20、 CPT 相 关的 许 多 序 列 信 息 ， 从 中 选 择 物 种 相 近的 1 个 ， 然 后 将 其 序列 与 GenBank 中 相 关 序 列 进行 比较 11。 2.3.2 序 列 同 源 性分 析 与 比 较 。 运 用 DNAStar 等 相 关 软 件 10 序列编辑与整理 （ DNA star， DNAMAN 等 ） 确定引物设计的位置 （ Blastn/p， ClustalW 等 ） 引物设计 （ Primer premier 5.0， 简称 PP 5 等 ） 获取序列 （ NCBI， Gramene， EBI 等 ） 引物特异性比对及综合评价 （ Blastn， Ol

21、igo 6.0 等 ） PCR 扩增试验验证 （ 凝胶成像系统 ） 图 1 引 物设 计流 程 进行 序列 比较 ， 具 体步 骤为 打开 DNAStar， 点 击 MegAlign，在 File 菜 单 中 选 择 Eenter Sequences， 在查 找 范 围 对 话 框 中 将 上述 获得 的目 的序 列复 制 ， 点击 Done， 软 件就 自动 把输 入的 所有 序 列进 行比 较 ， 确 定 同源 性区 域 。 找 出同 源 性较 高 的区 域 ， 在 该 区域 内 选择 出 引 物设 计 的模 板 ， 通 过以 上 的 计算 机操 作 便可 以完 成图 1 所示 的序 列

22、编辑 与处 理以 及 引 物设 计位 置的 确定 。 2.3.3 使 用 Primer Premier 5.0 设 计 引 物 。 Primer Premier 5.0 是用来 设 计最 适合 引 物的 应用 软 件 ， 利 用其 高 级引 物 功能 ， 进 行引 物 数 据库 搜 索 、 巢 式引 物 设 计 、 引物 编 辑 和 分析 等 ， 可以 设计出 有高 效扩增 能力的 理想 引物 ， 也 可以设 计出 用于 扩增 长达 50 kb 以上的 PCR 产 物的 引物序 列 。 该软 件主 要由 GeneBank 序 列 编 辑 、 Primer 引 物 设 计 、 Align 序 列

23、 比 较 、 Enzyme 酶切分析和 Motif 基序分 析等几个主要功能板块组成 。 以 CPT 为 例设计 引物 ， 可以直 接打 开 Primer Premier 5.0， 点 击 File 菜单 New 中 DNA Sequence， 然 后 在下 面 空 白 处输 入 CPT 基 因 序列 ， 出 现新 界 面 ， 点 击 Primer， 再点 击 Search， 弹 出对 话 框 ， 点 击 OK 按 钮 ， 出 现含 有 各种 可 能 引物 信 息的 新窗 口 。 通 过 点击 相应 引物 搜 寻界 面中 的 各对 引物 ， 便 会相 应 显示 引 物 的各 种 信 息 。 最

24、 后 在 引 物 编辑 窗 口 对 程序 自 动 和 手工 找 到 的引 物 序 列 进行 编 辑 ， 并 根据 具 体 基 因 引物 设 计的 类型 、 研究 目的和 意义 进行 选择 。 该软 件 虽 然 能够 全 面 的 给出 引 物 的 各 种参 数 ， 并 从 多 个 角度 对 引 物 做出 有 效 的综 合 评 价 ， 但是 在 程 序 设 计 中还 有很 多 不足 之处 ， 例如 在 错配 预测 的判 断 上不 够准 确 ， 无法 再使 用 结合 错配 的具 体 配对 情况 进 行综 合分 析 ； 另 外 ， 程序 对 于产 物 的 Tm 值和 引 物 Tm 值之 间 的 差 异

25、 也 未 能 给出 评 价等 。 2.3.4 BLAST 比对 。 首先 登录 http：/www.ncbi.nlm.nih.gov， 然 后 点击 BLAST； 其 次 进 入 Nucleotide blast， 在 Search 对话 框 中 将上 述获 得 的 序列 复 制粘 贴 ， 点击 BLAST GenBank， 将自 动 把输 入 的 序 列与 序 列 资源 库 中 所 有相 关 序 列进 行 比 较。 在比 较 结果 中列 出所有 的相 关序列 比较的 情况 ， 当 然也 包括 同一 物种 不同 长 度及 不同 物 种已 在 GenBank 中 登 记的 相关 基因 序列 的综

26、 合比 较 。 如 果 是 对 特 异 引 物 的 特 异 性 分 析 ， 还 可 以 登 录 www. Gramene.org 前 后 引物 Blastn 位 置分 析 如 均 只 在 基因 组的 相 近位 置有 完全 匹 配 ， 则 可认 为 具有 较好 特异 性 。 然后 可以 根据研 究目 的选择 使用相 应的 序列比 较资 料 ， 也可 以 利 用 结果 中 提 供 的信 息 获 得自 己 最 需 要的 一 种 基因 序 列 ， 为 49 12 13 农业 基础 科学 11 现代 农业 科技 2011 年 第 17 期 下一 步的 PCR 引 物设计 打下 基础 ，具体 操作流 程见

27、 图 1。 物具备很 好的随机性 ，可以同 时扩增多个 位点，主要用 于非特 2.3.5 筛 选 后 引物 的 综 合 评 价 。筛选 后 引 物 首 先 可 以 在软 异分 子标 记等 。简 并引 物，即 有较 强的 简并 性，如果 一个 PCR 件 上进 行 分 析 评价 ，设 计 引物 的 软 件 一般 要 具 备 引 物 分析 评 价功 能。各 种软 件侧 重 点有 所不 同 ，在 引 物分 析评 价 功能 方 面 ，通 过 综 合 比较 ，以 Oligo 6.0 软 件 最优 秀 ，可 快 速设 计 出高 成功 率 的引 物 。 Oligo 6.0 是 目 前使 用最 为 广泛 的引

28、 物 设 计软 件 ，除 了 可以 简 单 快捷 地 完 成 各种 引 物 和 探针 的 设 计与 分 析外 ，还具 有很 多 其他 同类 软 件不 具 有的 高级 功能 。 可 以 依照 引 物 设计 原 则 ，运 用 DNAStar 软 件 对 引 物 进行 分 析 ：打开 DNAStar，点 击 Primer Select，在 Report 菜 单 中分 别 选 择 Primerself Dimers、 Primer pair Dimers、 Primer Hairpins， 进行 引物自身 和引物 之间的 分析，筛选出 符合要求 的引物12。 然后 可以 通过 PCR 扩增 后的 凝胶

29、成 像系 统进 行试 验验 证 ：一是 PCR 产 物 的 量以 及 PCR 扩 增 的特 异 性 和效 率 ；二 是 是否 会形 成引 物 二聚 体条 带 ；三 是 以 DNA 为 模板 设 计引 物 时 ， PCR 扩 增 产 物 是 否 与 预 期 PCR 产 物 大 小 相 当 。图 2 是该文在 前面所提及 的银杏 CPT 的 PCR 产 物电泳图，可以看 出该 PCR 产物 不仅 产量 高，而且 特异 性条 带非 常明 显，无发 夹结构和引物二 聚体，产物与预 期 PCR 产物大小基 本上相同。 M 1 500 bp 2kb 图 2 银 杏 CPT 的 PCR 产物 电泳 图 注：

30、 M-Marker DL2000； 1-CPT 的 3-RACE 产物。 2.4 引物 设计 后基 因的 重新 检测 引物 多 次筛 选是 为 了 在 设计 的多 对 引物 中 找出 适 合进 行 特异 、高 效 PCR 扩 增 的引 物 。主 要 应 注意 以 下 2 点 ：一是 将得 到的一系 列引物 分别在 GenBank 中进行 回检 ，即 把每条 引 物 在 比 对 工 具 （ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）的 blastnr 中 进行 同 源 性 检索 ，弃 掉 与基 因 组 其 他部 分 同 源 性比 较 高 的 引物 ，也 就是 有 可能

31、形 成错 配 的引 物 。一 般 连续 10 bp 以 上 的 同 源 有可 能 形 成 比较 稳 定 的错 配 ，特 别 是引 物 的 3端 应 避 免 连 续 5 6 bp 的 同 源 。二 是 以 mRNA 为 模 板 设 计 引 物 时，要 先 利 用 生物 信 息 学 的知 识 大 致判 断 外 显 子 与内 含 子 的剪 接位 点，然后 弃掉 正好 位于 剪接 位点 的引 物 14。 3 引物 类型 及引 物设 计的 注意 事项 3.1 引物 类型 及应 用范 围 试验 中 一 般涉 及 到 的引 物 都 是 人工 合 成 的 短链 DNA， 以 便用 于 后期 的 PCR 反应

32、或 者测 序 验证 。目 前所 设 计 引物 的主 要 类型 为特 异 性引 物、非 特异 性 引物 和简 并 引物 。特异 性 引物 通常 有 很大 的特 异性 ，可以 扩 增单 个位 点 ，主 要 用于 特 异 分子 标 记 、基因 克 隆 、测 序和 RT-PCR 等 。非 特 异性 引 50 10 引物 在其某 几个 位置有 几个 可能的 碱基即 被称 为简 并引 物， 主要 用于 同源 基因 或保 守结 构 域 克隆 ，如 TAIL-PCR 等 15。 3.2 引物 设计 时的 注意 事项 3.2.1 引物自 身及 引物之 间不 应存在 互补 序列 。引 物自 身存 在 的互 补 序

33、 列 会形 成 发 夹结 构 和 引 物二 聚 体 ，影 响 引物 与 模板 的 复性 结合 。自身 连 续互 补的 碱基 数 宜少 于 4 个 。引物 二 聚体 及 发 夹结 构 如 果 不 可 避免 ，应 尽 量 使 其 G 值不 要 过 高 ， G 值 是 指 DNA 双链 形 成 所 需 的 自 由能 ，它 反 映 了 双 链 结 构 内 部 碱 基 对 的 相 对 稳 定 性 ， G 值 越 大 ，则 双 链 越 稳定 16。 3.2.2 引物 长 度以 及 GC 含 量 合适 以 保证 合 适的 Tm 值 。特 异 引物 长 度 一 般 在 1827 bp，但 不 应 大 于 38

34、 bp，引物 过 短 会影响 到扩 增的 特异 性，过长 会导 致其 延伸 温度 大于 74 ， 不 适于 Taq 酶 扩 增反 应 ，会 影 响扩 增 速 率 17-18。如 果 扩增 产 物 500 bp，引 物 长 度 为 1618 bp 即 可 。若 扩增 产 物 为 4 5 kb，引物 最 好不 要少 于 24bp。引 物 3末端 应 含 有所 研 究基 因特 异序 列中 的 1730 bp18。 Tm 值 是 寡 核 苷 酸 的 解 链 温 度 ， 即 在 一 定 盐 浓 度 条 件 下 ， 50% 寡核 苷 酸 双链 解 链 的 温度 。 Tm 值 5580 为宜 ，上 下 游引

35、 物 间的 Tm 值 差异 最 好 在 10 以内 。 GC 含 量 一般 以 40%60%为 好 ，上 下 游引 物 间 的 GC 含 量 差 异 在 20%以 内最 好 ，这 样可 以 适当 提高 引 物的 特异 性 。一 般 退火 温 度比 Tm 值 低 515 。 2 条 引 物 的 Tm 值 最 好 相 同 ，相 差 不要 超 3 3.2.3 引 物 3端不 能 选 择 A，最 好 选择 T。当引 物 的 末 位碱 基 为 A 时 ，即使 在 错 配的 情 况下 ，也 能 引 发链 的 合 成 ，而为 T 时 ，错 配的 引 发效 率 大大 降 低 。 G、 C 错配 的 引发 效

36、率 介于 A、 T 之 间，则 3端 最好 选择 T，提 高扩增 效率 。还应 注意 碱基 分布 的 均衡 性，引 物应 避免 嘌 呤或 嘧啶 的 堆积 现象 ，避 免连 续出 现 4 个以 上的 同一 碱基 。 3.2.4 引 物 序 列 在 模 板 内 应 当 没 有 其 他 相 似 性 较 高 的 序 列。尤 其是 3端 ，如 存 在相 似性 较高 的 序列 ，容易 导致 错 配。 解决 策略主 要是 使引物 中 4 种 碱基 随机分 布，尤其 3端不应 超过 3 个连 续的 G 或 C，否 则会使 引物 错配在 GC 富 集区17。 3.2.5 扩增 产 物的 单链 不 能形 成二 级

37、 结构 以 及 特异 性 引物 要 具有 特 异 性 。某些 引 物 无效 的 主 要 原因 是 扩 增 产物 单 链 二级 结构的 影响，选择扩 增片段 时最好避 开二级 结构区 域 。 特 异性 分 析 方法 为 引 物 设计 完 成 以 后，应 对 其 进 行 BLAST 分 析。 DNA 序 列的 保 守 区是 通 过物 种 间 相 似序 列 的 比 较确 定 的，在 NCBI 上 搜 索不 同 物 种的 同 一 基 因 ，通 过 序 列 分析 软件 比对 各基 因相 同的 序列 就是 该基 因的 保守 区。 3.2.6 引 物 5端 可 以 修 饰 ， 3端 不可 修 饰 且 要 避

38、 开 密 码 子 第 3 位。引 物 5端 修 饰包 括加 酶 切位 点、引 入突 变 或插 入缺 失 突变 序 列 、引入 启 动 子 序列 、标 记 各种 生 物 素 等 。引物 的 5端对 扩 增 特 异性 影 响 不大 ，可 进 行 修饰 ，引 物 的 延 伸是 从 3端 开 始 的， 3端 不 能 进 行任 何 修 饰 。如 扩 增 编码 区 域 ， 引 物 3端 不 要终 止 于 密码 子 的 第 3 位 ，因 密 码子 的 第 3 位 易 发生 简 并 ，会影 响 扩 增 的特 异 性 与 效率 。另 外 ，应 当选 用 6 11 11 18 尤 超等 ： PCR 引物 设计 方法 综述 3 LINZ U， DELLING U， RUBSAMEN-WAIGMANN H.Systematic studies 5端和 中间