PCR引物流程设计详解.doc

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1、PCR引物设计流程详解本文目的:复制出IL-4基因片段一、 查找基因序列1、 进入NCBI主页,下拉选框选择Nucleotide,在搜索栏输入要查找的目的基因,即IL-4,点击搜索2 、在搜索结果选择灵长类(Homo sapiens)2、 在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列3、 查看基因的相关信息外显子区域CDs区域4、 点击FASTA格式,并将序列保存到文档二、 使用primer premier 5.0设计引物1、 建立新文件,将所得的序列复制进输入框内2、 点击搜索按钮,搜索引物3、 设置引物设计参数(因为在之前查找基因序列的时候获知,外显子区域分别为:1-200、201-248

2、、249-425、426-618,又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子,PCR产物长度通常为100-150bp,故设定上游引物位置为201-248,下游引物位置为249-425,产物长度为100-150bp)4、确认条件后,显示搜索结果4、 双击选中得分最高的引物查看引物情况(上图为上游引物情况,下图为下游引物情况)5、 将设计的上下游引物复制出来,保存到文档中三、 使用oligo 6.0对设计的引物进行评价1、 建立新文件,将从cnki上获得的cDNA复制进输入框,并点击accept接收2、 接收后显示出该序列的相关信息3、 点击edit按钮录入用primer设计的上游引物,每一次输入

3、新数据后都需要点击accept按钮接收4、 同理,录入下游引物5、 分析上下游引物二聚体形成情况6、 分析上下游引物发卡形成情况7、 分析上下游引物GC%8、 检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况9、 分析PCR整体情况四、 引物特异性检验(primer blast)1、 进入NCBI主页,并选择blast2、 选择primer blast3、 在输入框内输入模板序列和上下游引物,并设定对比数据库,点击get primer进行对比4、 查看blast结果Blast 结果显示,尽管IL-4与其它基因有相似区,但是引物的3端没有完全互补。故设计的引物能特异性的扩增出目的基因17流 基详基出性特的故互有 物但相基其-管,果 结结对进 据数定引上序入框 择页 检性情 情错位模 引下 下情成发下情形聚引引入接按 要后据次每引计 用按 信信序示接 点框入制 得 从件评行引对0 档文保出物下的况情下下况游上情引查高最结搜示件 0度物 置物下 - 物游故0- 通度 子含越置物时物, :别子,候列基前为数计引搜,框输复的所,引设. 文到序, 区区信信序 需中-类 (择结在搜搜- 因的要栏在 框下主序因片基 出的

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