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1、会计学1PCR引物设计引物设计(shj)方法和原理方法和原理PPT课件课件第一页，共12页。一、引物设计一、引物设计(shj)的目的的目的n n获得目标片段获得目标片段(pin dun)n nDNA测序测序n n基因克隆基因克隆n n体外转录体外转录n n突变突变n n探针设计探针设计n n分子标记分子标记第1页/共12页第二页，共12页。二、引物设计二、引物设计(shj)的类型的类型n n常规常规(chnggu)PCR引引物物n nPCR同源引物和简同源引物和简并引物并引物n n探针探针第2页/共12页第三页，共12页。引物设计引物设计(shj)的步骤的步骤n n下载下载DNA模板或蛋白质模
2、板或蛋白质序列序列n n进行同源比较进行同源比较(bjio)，找到保守同源序列，找到保守同源序列n n设计引物设计引物第3页/共12页第四页，共12页。四、四、PCR引物设计引物设计(shj)的原的原则则n n引物长度（primer length）:18-27 bp n n GC钳(GC clamp:引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误(cuw)引发机率增加n n3末端碱基（3End Sequence）:n n Tm 值(melting temperature)：5260 n nGC 含量（composition）：40-60%第4页/共12页第五页，共12页。四、
3、四、PCR引物设计引物设计(shj)的原的原则则n nG 值是指DNA 双链形成(xngchng)所需的自由能(internal stability,用G 值反映):选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物 n n引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值:超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行n n引物的修饰:一般是在5端增加酶切位点 第5页/共12页第六页，共12页。Breslauer,邻近法的相邻核苷酸的邻近法的相邻核苷酸的动力
4、学数值动力学数值(自由自由(zyu)能能)来预来预测双链稳定性测双链稳定性 第6页/共12页第七页，共12页。五、简并引物的设计五、简并引物的设计(shj)第7页/共12页第八页，共12页。五、同源五、同源(tn yun)引物设计引物设计 第8页/共12页第九页，共12页。六、网络免费六、网络免费(min fi)在线引物设计软在线引物设计软件件第9页/共12页第十页，共12页。六、引物设计常用六、引物设计常用(chn yn)商业软商业软件包件包第10页/共12页第十一页，共12页。七、七、Primer Premier和和Oligo引物软件引物软件使用使用(shyng)方法方法n n常有引物设计
5、软件的引物的自动搜索常有引物设计软件的引物的自动搜索常有引物设计软件的引物的自动搜索常有引物设计软件的引物的自动搜索(su su(su su)和评价分析和评价分析和评价分析和评价分析 n n 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以
6、“Oligo 6”“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索最优秀；其次是引物的自动搜索最优秀；其次是引物的自动搜索最优秀；其次是引物的自动搜索(su su(su su)功能，各种功能，各种功能，各种功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索(su su(su su)的结果也不的结果也不的结果也不的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索尽相同。据笔者的经验，自动搜索尽相同。据笔者的经验，自动搜索尽相同。据笔者的经验，自动搜索(su su(su su)功能以功能以功能以功能
7、以“Premier“Premier Primer”Primer”为最强且方便使用，为最强且方便使用，为最强且方便使用，为最强且方便使用，“Oligo 6”“Oligo 6”其次，其他软件如其次，其他软件如其次，其他软件如其次，其他软件如“Vector NTI Suit”“Vector NTI Suit”、“Dnasis”“Dnasis”、“Omiga”“Omiga”和和和和“Dnastar”“Dnastar”都带都带都带都带有引物自动搜索有引物自动搜索有引物自动搜索有引物自动搜索(su su(su su)功能，但搜索功能，但搜索功能，但搜索功能，但搜索(su su(su su)结果不是十分理结
8、果不是十分理结果不是十分理结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索(su su(su su)的基础上还的基础上还的基础上还的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”“Oligo”和和和和“Premier”“Premier”软件合并使用，以软件合并使用，以软件合并使用，以软件合并使用，以“Premier”“Premier”进行自动搜索进行自动搜索进行自动搜索进行自动搜索(su(su susu)，“Oligo”“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。引物。引物。引物。第11页/共12页第十二页，共12页。