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1、中国科学 C 辑 :生命科学 2009 年 第 39 卷 第 1 期 : 121 128 中国科学杂志社 SCIENCE IN CHINA PRESS MicroRNA 靶基因的寻找及鉴定方法研究进展 夏伟 , 曹国军 , 邵宁生 军事医学科学院基础医学研究所 , 生物化学与分子生物学研究室 , 北京 100850 * 联系人 , E-mail: 收稿日期 : 2008-09-17; 接受日期 : 2008-11-28 国家重点基础研究发展计划 (批准号 : 2005CB724600)和国家自然科学基金 (批准号 : 30600110)资助项目 摘要 microRNA(mi RNA)的生
2、物学功能是人们非常关注的问题 . 而 miRNA 靶基因的确定 是研究 miRNA 生物学功能的关键 . 目前有关 miRNA 靶基因的确定主要靠计算机生物信息学 软件预测和生物学实验方法 . 其中生物信息学方法主要根据已证实的 miRNA 及其靶基因序 列之间相互作用的规律性 , 遵循几个常用原则设计的软件完成 , 如 miRanda, TargetScan 和 TargetScanS, RNAhybrid, DIANA-microT, PicTar, RNA22 及 FindTar 等 . 生物学实验方法主要 是利用免疫共沉淀寻找与 AGO 蛋白相互作用的 mRNA, 或研究受 miRNA
3、 调控的 mRNA 水 平和蛋白质水平变化来寻找 miRNA 靶基因 . 计算机预测方法和生物学实验方法相互补充和 完善 , 使人们能够更加方便地确定 miRNA 的靶基因 , 从而进一步研究其生物学功能 . 本文主 要介绍了 mi RNA 靶基因的寻找及鉴定方法的研究进展 . 关键词 miRNA 靶基因 预测 鉴定 microRNA(miRNA)是一类长度在 22 nt 左右的内 源非编码小 RNA, 广泛存在于动物、植物、病毒等多 种有机体中 . 1993 年 , Lee 等人 首先在秀丽隐杆 线虫 (Caenorhabditis elegans)体内发现了长度为 22 nt 的非编码小
4、RNA lin-4, 同时发现 lin-4 RNA 在 lin-14 基因的 3UTR 内存在着互补位点 . 进一步研究 表明 , lin-4 RNA 通过与 lin-14 基因的 3UTR 特异性结 合降低了 LIN-14 蛋白的表达水平 , 但对 lin-14 基因的 mRNA 水平影响并不显著 . 而 lin-4 RNA 便是现在所 熟知的 miRNA . miRNA 基因通常位于基因间或内 含子区域 , 在核内由 RNA 聚合酶 转录产生具有帽 子结构多聚腺苷酸尾巴的 pri-miRNA. pri-miRNA 在 核酸酶 Drosha 和其辅助因子 Pasha 的作用下被处理 成由 7
5、0 个核苷酸组成的 pre-miRNA, 经 export in 5 等 蛋白转运到细胞质中 . 另一个核酸酶 Di cer 将其剪切 成约 22 个核苷酸长度的 miRNA 双链 , 其中一条为 成熟的 miRNA 分子 . 成熟的 miRNA 分子在细胞内与 Argonaute 蛋白等形成 RNA 诱导的沉默复合体 (RISC), 并作用于特异 mRNA 的 3UTR, 从而抑制翻译 过程 或直接降解 mRNA . 已有研究 表明 , miRNA 通过作用于相应靶 mRNA, 参与细胞增殖、凋亡、分 化、代谢、发育、 肿瘤转移等多种生物学过程 . 预测超过 1/3 的人类基 因都是保守的
6、miRNA 靶基因 . 但目前为止 , 仍有很 多 mi RNA 的功能并不清楚 , 原因在于目前已经确定 的 miRNA 靶基因数量很少 , 而且 mi RNA 靶基因的预 测与鉴定 难度较大 . 因此 , 准 确快速地 预测 并鉴定 miRNA 的靶基因 , 对研究 miRNA 功能以及 mi RNA 所参与的生物学过程具有十分重要的意义 . 1 miRNA 靶基因的寻找 目前主要利用生物信息学方法 和生物学实验方 121 * 1, 2 3 4 5 610 夏伟等 : MicroRN A 靶基因的寻找及鉴定方法研究进展 法寻找 miRNA 的靶基因 . 1.1 生物 信息学方法 生物信息学
7、方法主要 是利用某种算法对靶基因 样本进行评分及筛选 . 与预测动物 miRNA 靶基因相 比 , 植物 miRNA 靶基因的预测要简单得多 , 因为在 植物中 miRNA 与靶基因几乎是以完全互补配对的方 式结合 , 预测时无需复杂的算法 . 目前几个针对植物 miRNA 靶基因的预测方法基本是基于此原理设计的 , 且准确率较高 . 本文将重点讨论动物中 miRNA 靶基因的预测方法 . (1) 利用常用规则进行预测 . 使用计算机预测动 物中 miRNA 靶基因是一件十分 困难的事情 , 主要是 因为目前已知的 miRNA 靶基因及其确切的靶点并不 多 , 在算法编写过程中没有足够的已知样
8、本可参考 , 不断增加和改进限制条件 , 也难以获 得同时具有高 特异性和高灵敏度的算法 . 并且 , 目前对计算机预测 出来的靶 基因 也没有 一个快 速的 高通量 鉴定方 法 , 这也在很大程度上影响了对 算法准确性的评估 , 无 法对其进行优化 . 但是 , 人们在研究过程中仍然发现 , miRNA 和靶 基因间的作用具有一定规律性 . 目 前的预测方法虽 然各不相 同 , 但 主要遵 循 以下几 个常用原 则 : ( ) miRNA 与其靶位点的互补性 ; ( ) miRNA 靶位点在 不同物种之间的保守性 ; ( ) mi RNA-mRNA 双链之 间的 热稳 定性 ; ( ) mi
9、 RN A 靶 位点 处不 应有 复 杂二级结构 ; ( ) miRNA 5端与靶基因的结合能力强 于 3端 . 除以上几个基本原则外 , 不同的预测方法还 会根据各自 总结的规律对算法进行不同的限制与优 化 , 下面概括介绍几种常见的预测方法 . ( ) miRanda. miRanda 是最早的一个利用生物 信息学对 miRNA 靶基因进行预测的软件 , 由 Enright 等人 于 2003 年设计开发 . 作为最早的 miRNA 靶基 因预测软件 , miRanda 对 3UTR 的筛选依据主要是从 序列匹配、 miRNA 与 mRNA 双链的热稳定性以及靶 位点的保守性三个方面进行分
10、析 . miRa nda 软件首先选取了黑腹果蝇 (Drosophil a melanogaster)中已知的 73 条 miRNA 作为探针 , 采用 类似于 Smit h-Wat erman 的算法对 9805 个 3UTR 进行 碱基互补分析 . 首先 , 互补参数被设定为 : G C, A 122 U 为 +5, G U 为 +2, 其他配对方式为 3, 同时起始空 位 (gap-openi ng)罚分为 8, 延伸空位 (gap-extension)罚 分为 2; 其次 , 为体现与靶基因作用过程中 miRNA 5端和 3端的不对称性 , 5端的前 11 个碱基的互补分 值 (com
11、plementarity scores)将乘以一个 scale 参数 ; 最 后 , mi RNA 与靶 mRNA 的互补还要遵循以下 4 个规 则 : miRNA 第 24 位碱基和靶基因精确匹配 ; 第 3 12 位碱基和靶基因错配不得多于 5 个 ; 9L-5(L 为 miRNA 总长 )位碱基最少一个错配 ; 最后 5 个碱基错 配不得 多于 2 个 . 在热稳定性方面 , miRanda 采用 Vienna 软件包计算 miRNA 与 3UTR 作用的自由能 (G). 此外 , 在物种间保守性方面 , 要求靶位点在多 物种 3UTR 比对中相同位置处碱基相同 . 综合以上 3 条原则
12、 , miRanda 选取每条 miRNA 相对的 3UTR 中排名前 10 位的基因 , 作为 miRNA 的 候选靶基因 , 对于多个 miRNA 对应于同一靶位点的 情况 , miRanda 则使用贪心算法 (Greedy Algorithm)选 取其中得分最高且自由能最低的那一对 . ( ) TargetScan 和 TargetScanS. TargetScan 是 Lewi s 等人 在 2003 年开发的一款用于预测哺乳动 物 miRNA 靶基因的软件 , 该软件将 RNA 间相互作用 的热力学模型与序列比 对分析相结合 , 预测不同物 种间保守的 miRNA 结合位点 . 与
13、miRanda 不同 , 在 Target Scan 的算法中 , 要求 miRNA5端第 2 8 位碱基与 mRNA 的 3UTR 完 全互补 , 这 7 个核苷酸被称作 “ miRNA 种子区 ”. 种子 区向两侧延伸直到出现 碱基错配为止 , 这期间允许 G U 配对 , 同时利用 RNAFold 计算结合位点的自由 能 . 此外 , TargetScan 中引入了信号噪声比来评估预 测结果的准确度 , 所谓信号噪声比即用已知 (信号组 ) 和随 机 生成 的 miRNA(噪 声 组 ) 分 别 对 mRNA 的 3UTR 进行预测 , 所得靶基因数目的比值 . 当仅针对 人 (Homo
14、 sapiens)和小鼠 (Mus musculus)的 3UTR 对 miRNA 靶位点进行预测时 , 信号噪声比为 2 1, 而 针对人、小鼠、大鼠 (Rattus norvegicus)的 3UTR 进 行预测时信号噪声比为 3.2 1, 当 研究范围扩大到 人、小鼠、大鼠和河豚 (Takifugu rubripes)时 , 信号噪 声比为 4.6 1. 随着物种数目的增多 , 预测得到的靶 基因减少 , 但准确性得到了相应的提高 . 11,12 13 13 中国科学 C 辑 : 生命科学 2009 年 第 39 卷 第 1 期 后来 , Lewis 等人 16 又对 TargetSca
15、n进行了优化 , 对 mi RNA 靶基因进行判断 : 首先 , 通过动态规划算 即 TargetScanS. TargetScanS 在人、小鼠、大鼠的基础 上增加了狗 (Canis familiaris)和鸡 (Gallus gallus)的基 因组数据 , 同时在算法上做了改动 , 将种子区由先前 的 7 个核苷酸调整为 5端第 27 位碱基共 6 个核苷酸 , 要求在种子区完全互补的情况下 , miRNA 第 8 位碱基 与靶基因互补或者 miRNA 第 1 位碱基是腺嘌呤 . 2007 年 , Andrew 等人 又将 TargetScanS 的算法中加入了 新的 条 件 , 即有
16、效 的 miRNA 结 合 位点 多 分布 于 3UTR 中 AU 富集的区域 ; 功能上具有协同作用的 miRNA 靶位点相近 ; mi RNA 的第 1217 个核苷酸与 3UTR 互补促进两者的结合 ; 有效的 miRNA 结合位 点优先分布于 3UTR 的两侧 , 但距离终止密码子至 少 15 个核苷酸 . ( ) RNAhybrid. RNAhybrid 是 Rehmsmeier 等 人 在 2004 年开发的一种基于分析 miRNA 和靶基 因间形成双链的二级结构 , 从而预测 miRNA 靶基因 的软件 . RNAhybri d 在实质上是一种经典 RNA 二级 结构预 测软 件
17、的 扩展 , 它克 服了当 时如 Mfol d 和 RNAFold 等 RNA 二级机构分析软件的不足 , 能够更 快速、更准确地计 算一条短链 RNA 和一条长链 RNA 杂交 如 ( miRNA 和 mRNA 3UTR)时的自由能 , 并基 于此来预测果蝇中 miRNA 的靶基因 . RNAhybrid 的 算法禁止分子内、 miRNA 分子间及靶基因间形成二 聚体 , 根据 miRNA 和靶基因间结合自由能探测最佳 的靶位点 . 2006 年 , Kruger 和 Rehmsmeier 对 RNAhybri d 软件进行了升级 , 在网络版的 RNAhybri d 上 , 用户可 以自由
18、选择种子区的位置、长度以及是否允许 G C 错配 , 同时还可利用种子区对待分析的 3UTR 数据 库进行初步过滤 , 加快了软件的分析速度 . 另一个新 功能就是增加了对非配对区及环状区 (loop region)长 度的限制 , 提高了软件预测的精确度 . ( ) DIANA-microT. DIANA-microT 是 Kiriakidou 等人 于 2004 年开发的一款结合了生物信息学和实 验学方法的靶基因预测软件 . DIANA-microT 主要考 虑单一结合位点的 miRNA 靶基因 . 此外在寻找结合 位点时 , 除了必需 的 5端种子区外 , 典型的中央突起 以及 miRN
19、A 在 3端与 mRNA 的结合也得到了考虑 . 在算法方面 , DIANA-mi croT 主要基于以下两点原则 法计算经典的 Watson-Crick 碱基对及 G U 错配的自 由能 , 进而衡量 miRNA 与靶基因间的结合能力 ; 其 次 , iRNA 相关蛋白影响 miRNA 与靶基因结合时形成 的中央突起的大小与位置 , 进而影响 mi RNA 与靶基 因的结合 . ( ) PicTar. Krek 等人 在 2005 年采用一种更 先进的算法来预测脊椎动物、线虫和果蝇中 mi RNA 的靶基因 , 并通过实验方法进行了验证 , 这种算法就 是 Pi cTar, 即组 合 靶 位
20、 点的 概 率 识 别 (probabilistic identification of combinations of target sites). Pi cTar 的 算法包括 两个方面 : 首 先 , 识别单个 miRNA 的靶位点 . 与大部分算法一样 , Pi cTar 同样强 调 “ 种子区 ”在 靶位点识别及在转录 后调控中的关 键 作用 , 强调 mi RNA 和靶基因结合的自由能在靶基因 翻译抑制中的关键作用 . 不同的是 PicTar 把种子序列 分为 “ 完全匹配种子序列 ”和 “不完全匹配种子序列 ”, 前者要求种子序列和靶基因 完全互补配对 ; 后者在 满足 miRN
21、A 与靶基因结合自由能不增加的前提下允 许种子序列出现错配 , 但不允许 G U 配对 . 同时 , Pi cTar 结 合 以前 实验 数据 对 两类 种子 序列 对 应的 miRNA 和靶基因结合自由能进行了限制 , 要求 “完全 匹配种子序列 ”的 miRNA 与靶基因结合自由能小于 miRNA 和靶基因最优结合能的 33%; 而 “不完全匹配 种子序列 ”的 miRNA 与靶基因的结合自由能要求小 于 miRNA 和靶基因最优结合能的 66%, 有效地降低 了假阳性率 ; 其次 , 为组合的靶位点评分 . 在 PicTa r 的概率模型中 , miRNA 在结合位点上互相竞争 , 通过
22、 对重叠靶位点给予适当的分值来识别多个 miRNA 作 用于同一靶位点 , 或一个 mi RNA 作用于多个靶位点 的协同效应 . 通过生物信息学 和实验方法的分析 , PicTar 算法 估计会 有 30%左右的假阳性率 . 还预测在脊椎动物 中 , 平均每条 miRNA 大约会与 200 个转录本相互作 用 , 而 mi RNA 簇在基因调控过程中起协同作用 . ( ) RNA22. RNA22 是由 Mi randa 等人 于 2006 年开发的 一种识别 mi RNA 靶位点以及相应 mi RNA-mRNA 异源双链 的软件 . RN A22 与其他 miRNA 靶基因预测软件不同 .
23、 首先 , RNA22 的预测 不依赖于物种间的保守性 , 而是认为即使近亲物种 123 17 18 19 20 21 夏伟等 : MicroRN A 靶基因的寻找及鉴定方法研究进展 不存在 miRNA 结合位点 , 仍有可能是 miRNA 的靶基 因 ; 其次 , RN A2 2 与 其 他软 件 的预 测方 向 不同 , RNA22 不是从 miRNA 入手寻找它的靶基因 , 而是首 先从感兴趣的序 列入手 , 寻找假定的 miRNA 结合位 点 , 再进一步确定其被哪条 miRNA 调控 . RNA22 可 以预测大部分已知的 miRNA-mRNA 异源双链 , 它的 出现对以前人们关于
24、 miRNA 靶基因预测的相关认识 提出了挑战 . 基因组中 miRNA 前体、结合位点以及相 关基因的转录本数目可能多于之前的预测 , 而 miRNA 的靶基因也可 能存在于 3UTR 以外的 区域 . 其中 miRNA 靶位点可能存在于 5UTR 的事实已经被证明 . 上 述 不 同 算 法 各 有 其 特 点 , 主 要 还 是 依 据 miRNA 与其靶位点的互补性、 miRNA 靶位点的保守 性、 miRNA-mRNA 双链之间的热稳定性及附近序列 的 二 级 结 构 等 原 则 设 计 的 . 其 中 miRanda 是 将 miRNA-mRNA 之间的序列匹配 , 保守性及热稳定
25、性 作为计算参数 , 有比较好的检出率 , 但是假阳性率也 较高 ; TargetScan 提出了 “种子区 ”的概念 , 增加了预 测的精确度 ; RNAhybrid 的研究重点在 RNA 二级结 构预测方面 , 能够更 快速准确地计算 miRNA-mRNA 双链的自由能 , 降低了假阳性率 ; DIANA-mi croT 则 主要考虑 miRNA 调控单个靶基因的情况 , 同时考虑 中央突起 以及 miRNA 在 3端 与 mRNA 的结合 ; RNA22 与 其他算 法不 同 , 不考虑 物种间的保 守性 , 检出率较高 . 利用常用规则进行 miRNA 靶基因预测的方法可 以概括如表
26、1. 可以看出 , 目前常见的生物信息学预 测方法各有其自身的特点和 适用范围 . 相信通过生 物学实验方法进一步验证 , 各种生物 信息学预测方 法也会互相补充 , 不断改进和完善 . (2) 其他规则的引入对预测的影响 . 随着 miRNA 靶基因预测方法的不断 增加 , 拟 定算法的标准及参 考依据也在不断更新 , 新的研究 进展及实验结果都 会对算法的更新起到推 动和促进作用 , 如机器学习 法的引入 , 结合现有实 验结果或基 因芯片结果 预测 miRNA 靶基因等 . 下面主要从新规则引入 对预测方法的影响方面进行介绍 . ( ) miRNA 和 mRNA 3UTR 结合特性对靶基
27、因 预测的影响 . 预测 miRNA 靶基因的关键 , 在于了解 miRNA 和 mRNA 3UTR 上其靶位点之间的相互作用 机制 , 使得在拟定算法时有更多的限制条件 , 从而增 加预 测精 确度 . 总 体来 说 , 了 解 mi RN A 与 靶位 点间相互作用主要从以下 3 个方面 , 即 5端种子区、 中间的环状突起区以及 3端的结合区 . Ye 等人 即是从中间环状区对 miRNA 与靶基 因间的作用机制进行探讨 , 结 合其他参数开发了一 个新的 预测软件 F indTar. 他们 以血管内皮生长 因子 (VEGF)为研究对象 , 将环状突起分成 3 种类型 : 将起始于 mi
28、RNA 5端第 911 个核苷酸的环称为标准 环 (standard loop), 将起始于第 9 个核苷酸之前的环称 为 型偏心环 , 将起始于第 11 个核苷酸之后的环称 为 型偏心环 . 分析了 miRNA 和其已知靶位点的结 合方式 . 同时验证了 VEGF 与不同 miRNA 的相互作 用 , 结果发现大部分 miRNA 与靶位点都是 以标准环 的形式结合的 . 经过对其他数据库的分析 , 确定了环 状区分值的标准 : 就环状区的位置而言 , 标准环为 1 分 , 型偏心环为 0.75 分 , 开始于第 7 个核苷酸 表 1 动物中 m iRN A 靶基因预测方法 预测方法 网址 检
29、索范围 算法特点 miRanda TargetScan/TargetScanS RNAhybrid DIANA-microT PicTar RNA22 http:/www.microrna.org/ http:/www.targetscan.org/ http:/bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/ http:/www.diana.pcbi.upenn.edu/ http:/pictar.bio.nyu.edu/ http:/ 人 , 果蝇 , 斑马鱼 人 , 小鼠 , 大鼠 , 狗 哺乳动物 人 , 小鼠 , 大鼠 , 果蝇 脊椎动物 哺乳
30、动物 序列匹配 , 双链结合自由能 , 物种间保守性 提出 “miRNA 种子区 ”的概念 快速准确计算 miRNA-mRNA 二聚体自由能 考虑 miRNA 调控单个靶位点的情况 区分 “完全匹配种子区 ”与 “不完全匹配种子区 ” 不考虑保守性 , 由 mRNA 入手预测相关 miRNA 124 24,25 2628 29 中国科学 C 辑 : 生命科学 2009 年 第 39 卷 第 1 期 或之前的 型环为 0 分 , 开始于第 8 个核苷酸的 型 环为 0.5 分 ; 就环状区的大小而言 , 1 bp 为 10 分 , 2 bp 或大于 3 bp 为 20 分 , 3 bp 为 25
31、 分 ; 最后将位置得分 和大小得分相乘得到最终的环状系数 . 利用荧光素酶报告基因的方法 , 从灵敏度、特异 性、约登指数 (youden index)等方面对考虑和不考虑环 状系数的两种方法进行比较 . 发现增 加了环状系数 的选项后 , 假阳性率降低 , 约登指数更加接近 1(约登 指数用于衡量预测准确性 , 理想值为 1), 但假阴性率 略有上升 . 总体来说 , 引入了环状系数后 miRNA 靶 基因预测的灵敏度和精确度有所提高 . ( ) 非结 合 位 点区 域 对 靶 基因 预 测 的影 响 . Didiano 等人 在 2008 年利用转基因线虫对 lsy-6 miRNA 与它
32、的靶基因 cog-1 3UTR 间的相互作用机 制进行了研究 , 发现在 cog-1 的 3UTR 中一个或多个 种子区的匹配并不能作为预测 miRNA 与靶基因相互 作用的标准 . 在之前研究 lsy-6 调控 cog-1 及异源的 3UTR 的过程中 , 他们曾发现将 cog-1 3UTR 靶位点 突变后 , lsy-6 确实失去了调控靶基因的能力 , 但其种 子区却依然与靶基 因结合 , 而且将 lsy-6 的靶位点构 建到 13 条异源基因上之后 , 并没有发现 lsy-6 对这些 基因的表达起到调控作用 . cog-1 基因的 3UTR 上存在着两个已知的 lsy-6 结合位点 ,
33、改变任何一个位点在 3UTR 中的位置都 会使得 lsy-6 失去对 cog-1 的调节作用 . 通过实验证 明 , 每个 l sy-6 结合位点后的一段序列对其与靶基因 的结合都起到至关重要的作 用 . 分别 对这两段序列 突变后显示 , lsy-6 对靶基因的调节作用减弱 , 而将这 两段 序列删除后发现 , l sy-6 对靶基因的调控作用会完 全 消 失 . 研 究 几 十 个 不 同 3UTR 之 后 , 认 为 在 miRNA 靶基因的预测过程中 , 除了在种子区的互补 序列以及针对靶位点的相关预测外 , 3UTR 的其他序 列甚至整个 3UTR 在 miRNA 的调控过程中也起到
34、了 关键作用 . 最近研究表明 , 线虫中有一组数量众多的 RNA 结合蛋白可以影响 miRNA 与靶 mRNA 结合效 率 . 他们分析 , 这些位于 miRNA 靶位点 3端的序列 有可能就 是 RNA 结合蛋白的作用位点 . 在今后预测 mi RNA 靶基因的过程中 , 除了传统 的算法外 , 还应考虑复杂的细胞内环境 , 如 miRNA 和 mRNA 与 RNA 结合蛋白间的相互作用 , 而这些是 无法通过目前的计算机 模拟进行计算的 , 需要新的 方法来提高预测精确度 , 基因组中受 mi RNA 调控的 基因数量可能并没有现在预测的那么多 . ( ) 靶基因二级结构的影响 . 在
35、miRNA 与靶基 因相互作用的过程中 , mRNA 3UTR 的二级结构也 起 着重要作用 . Zhao 等人 发现 , 几乎所有的 mi RNA 结合位点都位于 3UTR 的不稳定区域内 , 将靶位点 上下游 70 nt 序列的自由能列为参考因素 , 将为预测 提供一定的帮助 . 为研究靶基因二级结构对 miRNA 功能的影响 , Long 等人 在 2007 年利用 S Fol d 软件分析了 mRNA 的二级结构 , 并提出了 miRNA 与 mRNA 间作用的 “两步杂交模型 ”: 首先 , miRNA 与靶基因上的 4 个连 续未配对核苷酸结合形成核心碱基对 ; 之后 , miRN
36、A- mRNA 双链逐渐延伸 , 破坏靶基因原有的二级结构 , 并最终形成 miRNA-mRNA 的不完全互补双链区 . 该 模型的核心 在于计算靶 基因原有二级 结构的破 坏、 核心碱基对的形成和最终的 miRNA-mRNA 双链形成 过程中获得或损失的自 由能 . 他们分析了大量已公 布的数据 , 包括线虫中含有 lin-41 3UTR 序列报告基 因的体内活性 , 以及其他在线虫 和果蝇中得到实验 验证的 miRNA 与 mRNA 的相互作用等 , 发现利用 “两步杂交模 型 ”将 靶基因的二级结 构作为参考指 标 之一 , 和现有的数据吻合良好 . 直接的实验证据也表 明 , 增加靶位
37、点 附近二级结构的 稳定性可大大降低 miRNA 的作用 . 因此新的预测方法还需利用这一点 来提高预测精确度 . 通过上述方法可见 , 新的 技术手段能够为靶基 因的预测带来新的计算 参数 , 新的研究结果可以为 预测提供更多的学习样本 , 便于更好的总结规律、优 化方法 . 未来的靶基因预测方法 将会更多地依赖生 物学实验的研究进展 , 尤其是高 通量的靶基因鉴定 方法将会对计算机预测产生 重要的影响 . 1.2 生物学实验方法 由于计算机模拟在预测 miRNA 靶基因时存在一 定的局限性 , 因此很多学者也希 望能够利用生物学 实验方法直观地寻找 miRNA 靶基因 . (1) 从 mR
38、NA 水平寻找 miRNA 靶基因 ( ) miRNA 靶基因的大规模寻找 . 一种方法是 125 30 31 夏伟等 : MicroRN A 靶基因的寻找及鉴定方法研究进展 将 miRNA 成熟体双链或腺病毒载体转染至细胞中 , 体中 , 之后与构建的 miRNA 表达文库共转染 HepG2 使得 miRNA 在细胞中过表达 , 之后利用基因芯片分 33 细胞 , 得到荧光值明显下降 的 miRNA, 再将得到的 析 mRNA 的变化以找出相应 miRNA 的靶基 因 . 由 miRNA 在体内验证其功能 , 最终得到 Mi r-16 家族能 于 miRNA 在体内通过翻译抑制或影响 mRN
39、A 的稳定 够调节 CCND1 基因 . 该方法的关键在于 , 利用了自 性起作用 , 因此 这种方法在寻找起翻 译抑制作用的 miRNA 的靶基因时存在一定困难 . 此外 , Beitzinger 等人 利用 AGO 蛋白家族既能 结合 miRNA 又能结合 mRNA 的特性 , 分别 使用 AGO-1 和 AGO-2 蛋白的单克隆抗体在人类细胞中进 行免疫共沉淀 , 得到与 AGO-1 和 AGO-2 蛋白结合的 mRNA 各 600 条 , 并通过克隆测序对这些 mRNA 进 行鉴定 . 同时从与 AGO-1 蛋白结合的 mRNA 中随机 挑选 6 条进行荧光素酶报告基因检测 , 发现其
40、中有 5 条都是 miRNA 的靶基因 . 此外还发现 , 在与 AGO 蛋 白结合的 mRNA 中 , 只有大约 60%被 3 个最常用的 预 测 软 件 (miRanda, TargetScan 和 Pi cTar) 预 测 为 miRNA 的靶基因 , 说明现有的预测方法也许错过了 相当数量的 miRNA 靶基因 . 不过他们也指出 , 只有 高通量的 miRNA 靶基因验证方法出现之后 , 才能对 现有的各种预测方法做一个相对准确的评估 . 与上述工作类似 , Easow 等人 也是利用纯化 miRNP 来分析 miRNA 的靶基因 . 他们利用基因芯片 分 析了 miRNP 结合的
41、mRNA 后发现 , 大量计算机预 测的 miRNA 靶基因得到了富集 , 同时为了分析单个 miRNA 的靶基因 , 对野生型果蝇和 miR-1 缺失果蝇 的 miRNP 结合 mRNA 进行了分析 , 得到并利用实验 方法鉴定 miR-1 调节的 mRNA, 为 miRNA 靶基因的 寻找提供了新的思路 . 除上述工作外 , 我国武汉大学的 张翼教授课题 组也在通过利用 miRNA 与 AGO 抗体免疫共沉淀 得到与其相关的 mRNA, 从而建立寻找特异 miRNA 靶基因 的方法 (未发表资料 ). 本研究组也在尝试利用 一种 RNA 伴侣分子 , 在体外钓取与 miRNA 特异结合 的
42、 3UTR 序列 , 目前已取得了比较好的进展 (未发表 资料 ). ( ) miRNA 靶基因的精确寻找 . 最近 , Liu 等 人 在研究 Mir-16 家族的功能时建 立了一种针对 miRNA 靶基因的反向筛选法 . 首先 , 确定了感兴趣 的基因 ccnd1, 将它的 3UTR 构建到荧光素酶报告载 行构建的 miRNA 表达文库 , 能够方便同时研究多条 miRNA, 通过体外实验对候选 miRNA 进行初步筛选 , 从而快速地鉴定一条 mRNA 所对应的多条 miRNA. (2) 从蛋白质水平寻找 miRNA 靶基因 由于 miRNA 所介导的转录后翻译抑制过程不引 起 mRNA
43、 水平的改变 , 因此依据 mRNA 水平的变化 寻找 mi RNA 靶基因的方法在检出率上存在一定问题 . 不久前 , Selbach 和 Baek 两个研究组分别利用蛋 白质 组学 的 研究 方 法 , 建立 了 从蛋 白质 水 平 寻找 miRNA 靶基因的新方法 . 两个课题组分别将成熟 miRNA 双链转染 HeLa 细 胞 , 利 用 细 胞 培 养 稳 定 同 位 素 标 记 技 术 (stable isotope l abeling with amino aci ds in cell culture), 将转 染了成熟 miRNA 双链的细胞和正常细胞分别培养于 含轻 / 重型稳定同 位素标记必需 氨基酸的 培养基中 , 经过若干次细胞倍增后 , 稳定同 位素按照序列特异 的方式完全掺入到新合 成的蛋白质中 , 通过比较标 记 前后同一肽段的质谱峰值变化实 现对蛋白质的精 确定量 . 在检测了 20005000 个蛋白后 , 两个研究组 分别发现 , 转染一条 miRNA 后有几百个蛋白的表达 水平发生了改变 , 许多改变在 mRNA 水平