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1、免疫组织化学技术免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反响使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片病理大片和组织芯片和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回首性研究；石蜡切片制作经过对
2、组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原构成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所构成的交联毁坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某
3、种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用。抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低10-100mg/L，就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4-8条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现
4、假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中参加0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻枯燥后置-20下面可保存3-5年。保存稀释后的单抗应参加0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4下保存数月。多聚赖氨酸溶液Poly-L-LysineSolutionCat.No.:SGP8920Size:10mlConc.:0.1%w/v,inwaterStorage:18-26Thimerosal,0.01%,addedaspreservative多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分
5、子与组织切片上的阴离子互相作用会产生较强的黏合力。适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作经过中组织掉片。可以用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。使用讲明免疫学操作步骤可直接在玻片上涂布1灭菌的ddH2O1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。2用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-263将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。4在60烘箱1小时枯燥，或室温18-26过夜枯燥待用。注意1每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张，超过90张片子将影响其黏合力。2用之前的玻片必须保持清洁。必要时
6、用含1%HCl的70%乙醇溶液来清洗。4释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8，至少在3个月内是稳定的。5用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。订货信息￥100/10ml免疫组化操作规程一、仪器设备118cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2水浴锅二、试剂1PBS缓冲液pH7.27.4：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L。20.01mol/L柠檬酸盐缓冲液CB，pH6.0，1000ml：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。30.5mol/LEDTA缓冲液pH8.0：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用
7、10mmol/LNaOH调至pH8.0,加水至1000ml。41mol/L的TBS缓冲液pH8.0：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。5酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8)配制。b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。63%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液pH9.09.5等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。8TBS/PBSpH9.09.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.07.4合适于光学显微镜标本。三、操作流程1、脱蜡
8、和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。1组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2无水乙醇中浸泡5分钟；395%乙醇中浸泡5分钟；470%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1抗原热修复1高压热修复在沸水中参加EDTApH8.0或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液pH6.0。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。2煮沸热修
9、复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液pH6.0至95左右，放入组织芯片加热1015分钟。3微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液pH6.0至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔510分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，ChromograninA，Cyclin，ER，Heatshockprotein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，Topoismerase等。是以高温，高压对常规固定的石蜡
10、切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联经过中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团遭到影响，通过120高温或强碱处理后，可使交联打开。2酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37，切片也预热至37，消化时间约为530分钟；胃蛋白酶消化37时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。3、免疫组织化学染色SP法1脱蜡、水化；2PBS洗23次各5分钟；33%H2O280%甲醇滴加
11、在TMA上，室温静置10分钟；4PBS洗23次各5分钟；5抗原修复；6PBS洗23次各5分钟；7滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。8滴加抗50l，室温静置1小时或者4过夜或者371小时。94过夜后需在37复温45分钟。10PBS洗3次各5分钟；11滴加抗4050l，室温静置，或371小时；12II抗中可参加0.05%的tween-20。13PBS洗3次各5分钟；14DAB显色510分钟，在显微镜下把握染色程度；15PBS或自来水冲洗10分钟；16苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17自来水冲洗1015分钟；18脱水、透明、封片、镜检。SABC法1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各
12、5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭510分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加抗,室温1小时或者4过夜或者371小时4过夜后在37复温45分钟。8)PBS洗三次每次2分钟。9)滴加生物素化二抗,203720分钟。10)PBC洗3次每次2分钟。11)滴加试剂SABC，203720分钟。12)PBS洗4次每次5分钟。13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色镜下把握显色程度。14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。15)脱水、透明、封片、镜检。免疫组化实验经过中的要点和技巧1
13、固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比拟合适而推荐的固定液，请于购置前注意讲明书。BouinS固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，构造完好，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微构造及很多抗原的抗原性保存较好。2组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完好。3切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时
14、可适当地在水中参加几滴乙醇。4烤片：6030分钟或37过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5蜡块及切片的保存：最好在4保存6脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，合适于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理APES和Poly-L-Lysine的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES1：50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。7灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。8暴露抗原：对
15、于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，进而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体讲明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还能够用胃蛋白酶消化等。9封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10抗体稀释：应遵循“现用现配的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11背景高：在抗体浓度、反响时间、反响温度等适宜的条件下，假如背景照旧高，可采用含1Tween20的PBS洗，十分是在显色之前要多洗。12返蓝：在苏木素复染后，可用碱性
16、缓冲液如PBS或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。13显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。DAB法显示过氧化物酶原理过氧化物酶分解H2O2的经过中，下面反响不直接发生：AH2供氢体+H2O2A供氢体的氧化物+2H2O2实验可知，有称为复合物、的酶底物受氢体复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。免疫组化染色步骤以ABC法为例溶液的配置：1.0.1MPBS2000ml：NaCL18g,NaH2PO42H2O0.8g,Na2HPO412H2O12g.共六份2.柠檬酸盐缓冲液：储存液：0.1M柠
17、檬酸溶液A：21.01g柠檬酸+1L蒸馏水0.1M柠檬酸三钠溶液B：29.41g柠檬酸三钠+1L蒸馏水工作液：9mlA液+41mlB液+450ml蒸馏水0.01M柠檬酸盐缓冲液3.0.03%H2O2-甲醇：30%H2O20.4ml+400ml纯甲醇充分混匀4.20%甘油：80ml纯甘油+320ml蒸馏水5.稀释抗体：1300，1400，1600临用前配6.酒精的配置染色步骤：一步法1.载玻片烤箱中6040。2.二甲苯，6020(水浴箱中)，二甲苯，室温15。3.脱水，100%95%85%75%酒精，每级均为3。4.蒸馏水冲洗，PBS515.微波炉修复抗原：0.01M柠檬酸盐缓冲液，99肺20，
18、心肾126.PBS3*37.0.03%H2O2-甲醇，室温208.PBS冲洗，PBS3*3，甩干或纸巾吸去多余液体勿碰到组织，PAPPen划境线。9.blocksolution封闭抗原，室温10。10.倾出封闭液，不洗，滴加一抗60ul，4过夜或3712h。11.PBS冲洗，3*3。12.除去PBS，滴加A加强剂，室温25。13.PBS冲洗，3*3。14.除去PBS，滴加B剂，室温35。15.PBS冲洗，3*3。同时配置DAB显色剂。16.除去PBS，DAB显色10在显微镜下观察染色程度控制染色时间。蒸馏水冲洗。17.复染：苏目素均匀滴加2滴，40，蒸馏水冲洗，60温水泡半分钟。18.脱水：7
19、5%酒精85%95%100%3次，每级3。19.透明：二甲苯3，二甲苯3。18.封片：中性树脂，加盖玻片组织部位切勿残留小气泡，600.5h烘干。结果：棕褐色反响产物代表抗原X的定位。拍照1.更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。十分是在拍摄经过中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。2.数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。十分要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉3.免疫组化切片一般染色不太深，因而拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯
20、白色。测量其灰度应在250左右。假如呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。怎样正确判读免疫组化结果呢?我们以为:免疫组化染色结果断定必须建立在组织阳性、阴性对照实验成立的基础上.这样才有资格继续谈下面的问题.要正确判读免疫组化结果(1)首先要确定免疫组化技术能否合格，合格的染色结果应该是背景颜色浅淡或无着色，而阳性标志物明晰和定位明确。(2)不仅要判定所检组织中有或无阳性标记物，还要注意阳性信号的分布部位和形态特征。一般讲来，阳性信号应与被测抗原所在的部位一致。此处所讲的部位包括组织和细胞的不同区域。(3)阴性染色结果是组织内预期特定区域中未见抗原表达，但阴性结果不能立即以为能否定意义.