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1、免疫组织化学技术(ABC法)免疫组织化学技术ABCxx大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100和0.03%H2O2的0.01%磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)，室温30min；含3%牛血清白蛋白(BSA,Sigma)的PBS，室温30min；豚鼠抗HAP1抗体1:300，4孵育48h；PBS漂洗3次，每次10min；生物素化羊抗豚鼠IgG1:200室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min；ABC复合物(1:100)，2小时；PBS漂洗3次，每次10min；含0.03%DAB和0.006%H2O2的Tris盐酸缓冲液pH7.6室温13min；常规脱水、透明、树脂封片，显微
2、镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反响性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反响性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反响强度变化的统计学分析，*示与对照组比拟，P脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS，室温30min，含2%正常羊血清(NGS)和3%BSA的PBS，室温30min，入豚鼠抗HAP1抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100)，4孵育48h；PBS漂洗3
3、次，每次10min，参加RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG1:500，室温闭光2h，PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察，FITC用488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm氩氪激光激发，用570nm滤光片检测。HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1，B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R，C示A和B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。比例尺为20m。细胞进行处理后，弃培养基，用0.01MPBS漂洗3遍。参加4%多聚甲
4、醛固定30min。PBS漂洗3遍。参加3%Triton-x100的PBS，室温30min；含2%正常驴血清(NGS)和3%BSA的PBS，室温30min；分别参加小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200，Neuro-Marker公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体1:1000，sigma公司或兔抗NSE多克隆抗体1：100，北京中山生物技术公司4孵育48h；PBS漂洗3次，每次10min；入RodamineRed标记的驴抗兔/小鼠IgG1:500，JacksonImmunoResearchLaboratories，室温闭光3h；PBS闭光漂洗3次，每次10min；含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜OlympusFV500观察，EGFP用488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm氩氪激光激发，用570nm滤光片检测。