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1、免疫组织化学技术111免疫组织化学技术随着当代科学技术的迅速发展，病理诊断技术也在不断进步,其中免疫组织化学以其特异性强、灵敏度高等显著特点，克制了传统诊断方法的局限性和主观性，能将形态研究与功能、代谢研究有机地结合在一起，所以，这门新技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，此方法经不断改良和发展也日趋成熟，应用范围逐步扩大。目前已有近十种技术方法及几百种标记抗体，技术方法逐步规范化，标记抗体逐步商品化，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的很多领域，获得了令人瞩目的成就。一免疫组化技术的原理和优点一免疫组化技术的基本原理应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化
2、学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体第一抗体作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶常用辣根过氧化物酶或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后构成的免疫复合物是无色的，因而，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反响部位显示出来常用显色剂DAB显示为
3、棕黄色颗粒。通过抗原抗体反响及呈色反响，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可明晰看见细胞内发生的抗原抗体反响产物，进而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中但凡能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。二免疫组织化学染色方法按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了很多。按结合
4、方式可分为抗原抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶PAP法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物ABC法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法等，其中SP法是最常使用的方法。三几种常用免疫组织化学方法的原理1免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，进而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比拟广。2免疫酶标方法免疫
5、酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后参加酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞外表和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，比照度好，染色标本可长期保存，合适于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改良和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法、ABC法、SP法等。3免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属
6、颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因而，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术十分合适于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因而也合适进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。四免疫组化技术的优点1特异性强免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因而，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角
7、蛋白keratin显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只要当组织细胞中存在穿插抗原时才会出现穿插反响。2敏感性高在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只要直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；如今由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反响，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3定位准确、形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反响及呈色反响，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因此可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就能够进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究
8、的深化是特别有意义的。二免疫组化在病理诊断和研究中的作用由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的很多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。一确定细胞类型通过特定抗体标记出细胞内相应抗原成分，以确定细胞类型。如角蛋
9、白是上皮性标记，前列腺特异性抗原仅见于前列腺上皮，甲状腺球蛋白抗体是甲状腺滤泡型癌的敏感标记，而降钙素抗体是甲状腺髓样癌的特有标记。有些细胞如表皮内朗格汉斯细胞、黑色素细胞、淋逢迎内指突状和树突状网织细胞光镜下不易识别，但免疫组化标记S-100蛋白等能清楚显示其形态。二识别细胞产物利用某些细胞产物为抗原制备的抗体，可作为相应产物的特殊标记，如内分泌细胞产生的各种激素，大多数可用免疫组化技术标记出来，据此可对内分泌肿瘤作功能分类，检测分泌异位激素的肿瘤等。三了解分化程度大多数标记物都有其特定的分布部位，如上皮细胞膜抗原EMA着色部位在细胞膜上，但差分化乳癌胞浆内可以出现阳性颗粒；角蛋白的含量也与
10、分化程度有关，低分化或未分化癌含量较低、染色较弱。四鉴定病变性质通过标记Ig轻链、可区分部分B细胞性淋巴瘤与B细胞反响性增生，前者常表达单一的Ig轻链+/+，后者常为多克隆Ig轻链+、+。而标记bcl-2蛋白在区别滤泡型淋巴瘤和反响性滤泡增生上有相当的意义。在滤泡型淋巴瘤，90%以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2的高表达；而在滤泡反响性增生时，滤泡反响中心的细胞不表达bcl-2蛋白，而套细胞则表达。五发现微小转移灶某些癌的早期转移有时与淋逢迎内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法如用上皮性标志则特别有助于微小癌转
11、移灶的发现。对转移性肿瘤可以借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。六讨论肿瘤起源或分化表型一些来源不明的肿瘤长期争论不休，最后通过免疫组化标记获得共鸣。如颗粒性肌母细胞瘤，曾被以为是肌源性的，但该肿瘤肌源性标记阴性，而神经性标记阳性，证实为神经来源可能来自神经鞘细胞。分化很差的肿瘤病理上常按细胞形态分为梭形细胞肿瘤、小圆细胞肿瘤等，通太多种标记的联合应用，可以能确定来源。七确定肿瘤分期判定肿瘤是原位还是浸润及有无血管、淋巴管侵袭与肿瘤分期密切相关。用常规病理方法判定有时是特别困难的，但用免疫组化法可获得明确结果。如采用层粘连蛋白和型胶原的单克隆抗体
12、可清楚显示基底膜的主要成分，一旦证明上皮性癌突破了基底膜，就不是原位癌，而是浸润癌了，其预后是不同的。用第八因子相关蛋白、荆豆凝集素等显示血管和淋巴管内皮细胞的标记物则可清楚显示肿瘤对血管或淋巴管的浸润。对很多肿瘤的良恶性鉴别及有无血管或淋巴管浸润，这是主要的鉴别根据，同时也有治疗及预后意义。八指导治疗和预后免疫组化标记中与预后有关的标记大致可分为三类：类固醇激素受体：如雌激素受体、孕激素受体等，它们与乳腺癌的关系已获公认，性激素受体阳性者内分泌治疗效果较好，预后也较好。类似的结果也见于子宫内膜癌和卵巢癌。肿瘤基因标记：如癌基因c-erB-2，c-myc，P53蛋白等，在肿瘤中高度表达者，患者
13、预后较差；而nm23蛋白高度表达者，肿瘤转移率较低，预后较好。细胞增殖性标记：如表皮生长因子受体EGFR、增殖细胞核抗原PCNA、Ki-67等，表达指数越高，表明其增殖越活跃，恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67、PCNA、EGFR阳性者，淋逢迎转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。九辅助疾病诊断和分类人体的免疫性疾病，主要是本身免疫性疾病，如肾小球肾炎、皮肤本身免疫性疾病等，可用免疫组化方法对组织细胞内的免疫球蛋白、补体、免疫复合物等进行检测以辅助诊断。某些疾病的分类或分型也是在免疫组化基础上建立的。内分泌肿瘤如垂体前叶腺瘤，根据其分泌功
14、能可分为生长激素腺瘤、泌乳激素腺瘤等10型；胰岛细胞瘤的功能分类为胰岛素瘤、高血糖素瘤等6种；恶性淋巴瘤根据瘤细胞外表标志不同可分为T细胞性、B细胞性。肾小球肾炎的免疫学分类亦需免疫组化或免疫荧光技术。十寻找感染病因人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的构造，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒CMV、人乳头状瘤病毒HPV、单纯疱疹病毒HSV、乙型肝炎病毒HBV等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。三免疫组化技术的关键问题一组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色
15、成败的内部因素，在组织细胞材料准备的经过中，不仅要求保持组织细胞形态完好，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。假如出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即便用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。1组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开场，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm2.5cm0.2cm，切记取材时组织块宁可面
16、积大，千万不能厚的原则，(也就是讲组织块的面积能够大到3cm5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速浸透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。进而完好的保存抗原和组织细胞形态。对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，由于病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定能否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其浸透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，
17、一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐步降低。2组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。把握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即便能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色经过中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh3次，二甲苯透明lh2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65。二切片组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染色操作程序复杂，时间较长
18、，有些抗原是要进行各种抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片假如得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适当处理，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。1Poly-L-Lysine(多聚左旋赖氨酸)一般采用分子量30000左右的0.5%多聚赖氨酸最好，可以用试剂公司出售的其浓溶液以1：10去离子水稀释。方法是将玻片浸泡其中，倾尽余液，在60温箱中烤干备用，此方法的优点是能够用于多种组织化学、免疫组化及分子学检测中的应用，粘贴效果最好，但价格稍贵。2明胶硫酸铬钾法将2.5g明胶加热溶于500ml蒸馏水中，完全溶解冷却后参加0.25g硫酸铬
19、钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中2min，取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单，任何实验都能够使用，十分适用于大批量的使用，但应注意，假如液体变蓝或粘稠状停用。3APES(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)此法必须现用现配。将洗净玻片入1:50丙酮稀释的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸馏水中刷去末结合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片应垂直烤片不能平拷，否则组织片中易出现气泡。切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为34m，切好的切片在60温箱中过夜，注意烤片的温度不宜过高
20、，否则易使组织细胞构造毁坏，而产生抗原标记定位弥漫现象。三免疫组化染色方面SP免疫组化染色步骤SP免疫组化染色试剂盒采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。染色的主要经过如下：1石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH74)冲洗三次，每次3分钟(33)。2根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。3每张切片加1滴或50ul过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10分钟。4PBS冲洗33。5甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。6甩去血清，每张切片加1滴
21、或50ul的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4过夜，建议参阅每种抗体的讲明书。7PBS冲洗35。8甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul生物素标记的第二抗体试剂C，室温下孵育10分钟。9PBS冲洗33。10甩去PBS液，每张切片加1滴或50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。11PBS冲洗33。12甩去PBS液，每张切片加2滴或100ul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察310分钟，阳性显色为棕色或红色。13自来水冲洗，苏木素复染，0.1HCL分化，0.1氨水或PBS冲洗返蓝。14假如用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水枯燥，(二甲苯透明)，中性
22、树胶封固；假如用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。免疫组化染色方法已不是什么很难的问题，操作步骤简单也易把握，但要染好免疫组化，其中方法的技巧将是每位操作者在实际工作中不断探索和讨论的事，但最基本的应从下面方面加以注意。1去除内源酶及内源性生物素一般我们进行免疫组化标记的都是一些生物体组织，其中本身含有一定量的内源酶和内源性生物素，而免疫组化各种染色大部分是用过氧化物酶来标记抗体的，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，而组织中的内源性酶同样也能催化底物，使其显色，这就影响免疫组化的特异性，所以在标记抗体的过氧化酶进人组织切片之前就应设法将组织内的内源性各种酶灭活，以保证免
23、疫组化染色在特异性情况下进行。11去除内源酶常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。但在含有丰富血细胞的标本中，由于其中含有大量的具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢反响，出现气泡现象，易对组织构造和细胞形态产生一些不良影响，但用3%过氧化氢的方法，能够去除大部分内源性酶，即便有些血细胞在显色后也出现棕黄色反响，但由于其形态构造与组织细胞不同，也易鉴别，而且此方法比拟通用易操作，但应注意过氧化氢的浓度不能过高，一般为3%一5%，时间不宜过长，最好室温10min。12去除内源性生物素在正常组织细胞中也含有生物素，十分是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合
24、卵白素，构成卵白素一生物素复合物，导致假阳性，所以在采用生物素方法染色前可以以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。13灭活碱性磷酸酶最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)参加底物液中并保持pH值为7.68.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。2抑制非特异性背景着色非特异性着色最常见的情况是抗体吸附到组织切片中高度荷电的胶原和结缔组织成分上，而出现背景着色，为了防止这种现象，最好用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，不让一抗
25、与之结合，但这种方法一般实验室很难实现，一般常见实用的血清是2%10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用1030min即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。3缓冲液免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体最合适的pH值为7.27.6，最常用的是0.0lmol/LpH7.4磷酸缓冲液(PBS)。简易配法：5000ml蒸馏水中分别参加lgNaH2PO4、15.6gNa2HPO4、42.5gNaCl。但假如是采用碱性磷酸酶(AP)作为标记物底物的方法时
26、能够用0.02mol/LTBSpH8.2缓冲液比拟好。4抗原修复经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是由于甲醛固定经过中构成醛键或保存的甲醛会构成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因而，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制浓度与消化时间要适度。常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。在选用这三种加热法时，浸泡切片的缓冲液的离子强度和PH值、加热的温度和时间均影响着抗原修复效果。目前最常用的修复方法有如下凡种：41胰蛋白酶(Trpsin)主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.
27、1%，37作用10min。配法：0.1g胰蛋白酶参加到0.1%pH7.8CaCl2(无水)水溶液中溶解后即可。42胃蛋白酶(Pepsin)主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%，37作用30min。配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/LHCl水溶液中。43热引导的抗原决定簇修复(HeatInducedEpitopeRetrieval，HIER)HIER对大多数的抗体有益，尤其是对核抗原的修复作用愈加明显，最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液，它们的作用原理是通过钠离子的螯合而实现的。抗原修复液的pH值非常重要，有效的抗原修复pH值要比修复
28、液的化学成分更重要，同样的修复液随着pH值的升高染色的强度逐步加强，但最佳pH值范围为6.010.0，对于大多数抗原这个范围的pH值都能进行有效的修复，有些抗体(如Ki-67、ER)则在pH值l.03.0和6.08.0更为有效。作为通用修复液碱性pH值的修复液要比酸性的有效，而对固定很长时间旧的存档组织，酸性pH值的修复液则优于碱性的修复液，所以两种抗原修复液可作为互相替补的进行抗原修复。在进行HIER经过中应防止切片的枯燥，加热时必须到达规定的温度，保温时间要足够，对于一些不要抗原修复的抗体最好不要采用HIER处理，否则对染色无益，但有些抗体则需要利用多种修复联合应用。HIER方法有：431
29、水浴加热法将脱蜡人水后的切片放人盛有修复的容器中，放人加热煮沸水中，当修复液温度到达95左右时计时l5min，自然冷却，PBS洗3min3次。432微波加热法将切片放入修复液中微波加热使温度在96左右，计时l0min，在微波炉中停留2min，室温自然冷却，PBS洗3min3次。433高压加热法将修复液在高压锅中煮沸，切片插在染色架上，放入锅中(要使修复液淹没切片)开场喷气时盖上压力阀。计时2min，冷水冲至室温取出切片，PBS洗3min3次。5免疫组化试剂的标准化要求试剂公司提供标准化的试剂，并附具体的试剂讲明书，包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗
30、涤时缓冲液的适宜离子强度和PH值等。抗体的选择是开展免疫组化最重要环节之一。目前，抗体大部分来源于国外，抗体种类繁多，生产厂家各异，再经过中介渠道致有效期缩短，影响抗体效价甚至阳性不表达，因而对购入的抗体首先要进行检测。理想的抗体应具备特异性强、敏感性高和适应性强的特点。现实市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无须探索，但对于浓缩型一抗，则应探索出最佳的工作滴度，抗体的浓度过高或过低都将可能出现阴性结果，应该用一个适当的稀释度得到最佳的抗原染色强度和最低的背景着色。灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是最为理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化技术发展至今第三代SP试剂盒更优于其它试
31、剂盒(ABC、PAP等)。但应注意检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不出目的物。一抗的作用时间最好是4过夜，可以以用37lh，但后者在染色经过中应控制好温度、时间及其它抗体稀释度。51抗体选用一般来讲，多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反响较明显，效价不太稳定；但多克隆抗体制备简便，价格低廉，抗体效价较高，稀释度一般在11001000之间，适应性强，有部分多抗表达抗原特异性较好，如TG和PSA等，多抗CD3对石蜡切片标记T细胞适应性强，阳性率高。单克隆抗体的抗原专一性强，质量和效价稳定，非特异性反响较少，标记结果可靠，但单克隆抗体制备复杂，价格昂贵，抗体效价较低，稀释度在150100，如单抗
32、CD3只能在冷冻切片上表达，难在石蜡切片显色。目前市场上常有分装、稀释抗体出售，这种抗体有使用经济的优点，但稀释抗体减少了蛋白分子间相互保护的作用，因此效价不稳定，不易长期保存。进口试剂质量较好，但价格昂贵，十分是常用的第二抗体，染色经过短，敏感性高。因而，应根据实际需要选择适宜的抗体。52抗体分装购入的抗体除非只够数次用量一般需要分装在多个安瓿中，根据月需要量，大致每安瓿含520微升。除留下一支现用，其余应立即放置低温冰箱内储存-20下面。用一支取一支，以免长期保存在4冰箱内失效。53抗体稀释抗体使用一般按其工作浓度稀释，如1100，11000等等。一次用不完的抗体可保存在4冰箱内，尽量在1
33、2月内用完，而不要放在4冰箱的冰格中，由于温度在0下面，抗体会很快结冰，再次使用时又要融化，这样几次冻融，抗体效价会急剧下降而失效。用作抗体的稀释液，在夏天温度很高时，最好参加少许防腐剂如叠氮钠、柳硫汞等，以免在切片上作用时间超过10小时而生霉菌。54无菌与消毒保持使用中的抗体无菌是困难的，但是与抗体接触的工具如滴管、吸管、试管、安瓿以及加样器等最好经过消毒，尽量减少污染的时机，不然抗体极易污染细菌与霉菌，而迅速发生浑浊沉淀而失效。6显色免疫组化染色的显色是最后的关键问题，一般辣根过氧化物酶(HRP)的检测系统选用DAB或AEC显色系统进行显色。但要得到最佳的显色效果，必须在镜下严格控制，以检
34、出物到达最强显色而背景无色为最终点，尤其DAB显色时间短着色浅，时间长背景又深，都将影响结果判定，根据经历DAB在配制完后最长宜放置30min以内，过时不能使用，DAB加到组织切片时作用时间最长不宜超过10min(最好在5min内)，否则不管有无阳性都应终止反响。对一些含有内源性酶较高的组织用DAB显色时极易出现背景色更应尽早在镜下控制，以到达最佳的分辨效果棕色。AEC显色系统红色的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，同时染色的切片也不能久存。假如是碱性磷酸酶(AP)最好选用NBT/BCIP作为显色系统结果染为蓝黑色。7结果判定免疫组化的结果判定有两种方法：一是对以检测结果阳性
35、细胞指数来定性(如核抗原的标记)，判定方法是以一个视野中的阳性细胞数与总细胞的百分比，再取10个一样视野算取平均指数。另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在025为阴性，2550为十，5075为十十，75以上为十十十。此种断定方法容易出现人为误差现象。有条件的实验室最好能用图像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。一切的断定方法都是力求使免疫组化染色结果判定更标准，但各单位采取的标准不尽一样，所以判定标准化问题还有待长期实践中病理学术界商讨断定标准。IHC中常见的抗原表达形式有下面几种：1细胞浆内弥漫性分布，多数胞浆型抗体的反响如此，如细胞角蛋白(cytokerati
36、n，CK)和波形蛋白(vimentin)等；2细胞核周的胞浆内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色；3胞浆内局限性点状阳性，如CDl5抗体的染色；4细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如CD20、CD45RO；5细胞核阳性，如Ki-67及雌、孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗体可同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反响；CD30抗体可同时呈膜性和胞浆内点状阳性反响等。影响免疫组化染色质量的因素有很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当地选择和使用封闭和抗原修复手段，严格的技术操作和对照等。假阴
37、性反响可发生在：组织内待测抗原已被分解毁坏，或抗原含量过低；抗原被遮盖，多由于醛类固定剂的使用，使组织中的大分子蛋白借醛键构成交联而遮盖待检抗原；抗体质量不佳或稀释度不当；技术操作失误等。假阳性反响可发生在：抗体与非待检抗原发生穿插反响，在使用多克隆抗体时易出现；组织对抗体的非特异性吸附，十分是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液体时容易发生；内源性过氧化酶的作用，在脾脏、骨髓及一些炎性病变组织的染色中易出现；内源性碱性磷酸酶的作用，十分是肠黏膜上皮和肾近曲小管的刷状缘有高浓度的碱性磷酸酶，若处理不彻底，易出现假阳性结果；判定失误，将肿瘤组织中残留的正常组织的免疫组织化学阳性信号误以为是
38、肿瘤的染色反响；当肿瘤浸润毁坏正常组织时，使被毁坏的正常细胞胞浆内的可溶性蛋白释放，后者被肿瘤细胞非特异吸附或吞噬，使瘤细胞出现该种抗原的阳性反响；外源性和内源性色素的干扰。8对照片的设置免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照包括阴性对照、阳性对照和本身对照。在实践中可用染色组织切片中不含抗原的组织作为阴性对照，而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自己对照具有节约的意义。观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全经过技术操作准确无误，待检组织中的
39、阳性细胞也就是可信的正确结果。免疫组化染色中对照片的设置非常重要，它是判定您的染色能否成功的关键根据，而且也是检测每一个抗体的质量标准，常设的对照如下，一般实验最常用的只选第二种方法。81空白对照(阴性对照)第一抗体由PBS或非免疫血清取代。82阳性对照用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。83回收实验阴性对照已知抗原与相应的第一抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验，结果为阴性。84替代对照用于第一抗体同种动物的血清或无关抗体代替第一抗体结果为阴性。85本身对照在同一切片上，应将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比拟。如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，vimentin能够间质细胞，对照desmin以血管壁及肌束为对照，S-l00蛋白以小神经末梢为对照等，假如应为阳性的组织是阳性，则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。