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1、LAMP-HNB快速检测技术研究1.1实验方法1.1.1DNA模板的制备取1mL过夜培养的副溶血弧菌菌悬液，19830g离心2min，弃上清，沉淀根据细菌基因组DNA提取试剂盒大连宝生物工程有限公司讲明，提取细菌基因组DNA。1.1.2引物设计与合成以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目的基因序列，根据引物在线设计软件设计PrimerExplorer4.0，在线设计一套LAMP引物，由宝生物工程大连有限公司合成，引物序列见表1。1.2扩增体系1.2.1LAMP-HNB扩增体系反响体系25L:10反响缓冲液NewEnglandBiolabs2.5L，dNTPsMixtureTaKaRa1.4mmol
2、/L，外引物F3/B3各0.2mol/L，内引物FIP/BIP各1.6mol/L，MgS041.5L，甜菜碱Sigma1mol/L，BstDNA聚合酶大片段NewEnglandBiolabs8U，细菌DNA模板2L，HNB1L反响浓度150mol/L2，ddH2O补足至25L，配置好混匀离心，于65温育60min，80灭活10min，产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，同时肉眼观察反响体系的浊度和颜色变化。1.2.2PCR扩增体系反响体系25L：包括10PCRBuffe2.5LTaKaRa，MgCl22LTaKaRa，dNTP2LTaKaRa，上下游引物F3/B3各50nmol/L，DNA模板2
3、.5L，TaqDNA聚合酶0.3LTaKaRa，ddH2O补齐25L。反响程序:预变性955min；9530s；5830s；7245s；30个循环，72延伸10min。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。1.3特异性实验LAMP-HNB和PCR方法对4株副溶血弧菌菌株和14株非副溶血弧菌菌株进行扩增，观察实验结果。1.4灵敏度实验1.4.1基因组DNA灵敏度检测用试剂盒提取副溶血弧菌基因组DNA，用酶标仪测定OD值计算DNA浓度，10倍比例稀释DNA原液到10-110-9，同时进行LAMP-HNB和PCR反响。1.4.2细菌纯培养物灵敏度检测取振荡过夜培养的副溶血弧菌菌液，平板稀释法计算菌
4、液浓度，10倍比例稀释10-110-8，用LAMP-HNB法检测灵敏度，同时做PCR实验。1.4.3人工污染副溶血弧菌食品检测取经国标方法检测不含副溶血弧菌的牡蛎样品25g参加到225mL的NaCl碱性蛋白胨水中，用拍击式均质机均质2min。取8mL均质液参加已知浓度为1.41081.410CFU/mL浓度梯度的副溶血弧菌纯菌各2mL，各取1mL用试剂盒法提取DNA，提取DNA同时做LAMP检测和PCR检测。1.5对市售海产品进行检测从市场中采购海产品，其中包括带鱼、鱿鱼、海蛎子、花蚬子和多春鱼等40份。采用无菌操作的方法取鱼肉、鱼内脏、贝肉和虾腹节肌肉等25g参加到225mL碱性蛋白胨水，均
5、质，(361)培养1218h，接种到TCBS琼脂上，挑选可疑菌落接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36(1)培养1824h，根据GB/T4789.72013要求进行革兰氏镜检、氧化酶实验、嗜盐性实验、氯化钠三糖铁实验等生化鉴定试验，同时取1mL菌液根据1.2.1所提的方法，根据细菌基因组DNA提取试剂盒要求提取DNA用于LAMP-HNB和PCR实验。2结果与讨论2.1LAMP检测方法的建立针对副溶血弧菌tlh基因设计特异性引物进行扩增，根据羟基萘酚蓝指示剂的显色原理，羟基萘酚蓝HNB是一种金属离子指示剂，Mg2+与HNB结合使得反响体系初始颜色为紫罗兰色，随着反响的进行，Mg2+与析出的焦
6、磷酸根离子反响生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了Mg2+使得体系颜色变为天蓝色，而未反响的体系则仍保持着紫罗兰色，以此判定LAMP反响结果。如表2所示，LAMP-HNB发生扩增反响的反响管变为天蓝色，而未发生扩增反响的反响管仍保持紫罗兰色。如图1、2所示，LAMP反响产物在琼脂凝胶电泳上出现典型的LAMP反响阶梯状条带，肉眼观察反响管有较明显的沉淀出现，PCR方法观察反响结果在207bp处也有较明显的条带。2.2特异性实验如表3、4和图3、4、5、6所示，4株副溶血弧菌菌株(1、2、3、14号反响管)LAMP和PCR反响均出现特异性扩增条带，LAMP-HNB体系颜色为天蓝色(1、2、3、14号
7、反响管颜色为天蓝色)，其他14株非副溶血弧菌412、13、1516号反响管未出现特异性扩增条带，LAMP-HNB仍保持紫罗兰色412、13、1516号反响管颜色为紫罗兰色，反响有较强的特异性。2.3灵敏度实验2.3.1基因组DNA灵敏度副溶血弧菌基因组DNA浓度为5.45106fg/L，10倍比例稀释进行LAMP检测，如表5和图7、8所示，从反响管颜色变化和凝胶电泳图中能够判定，LAMP-HNB检测副溶血弧菌基因组DNA检测限约为109fg。用同样的基因组DNA进行PCR反响，当菌液浓度为5.45103fg/L时PCR反响不产生扩增条带。因而，LAMP-HNB检测副溶血弧菌纯培养物的最低检测限
8、为PCR的100倍1号空白反响管和911号反响管都为紫罗兰色，28号反响管为天蓝色。2.3.2副溶血弧菌纯培养物灵敏度采用平板菌落计数法得原菌液浓度为1.4108cfu/mL，把原菌液进行10倍比例稀释，各稀释梯度的菌液提取DNA进行扩增反响，如表6和图9、10所示，LAMP-HNB发生扩增的反响体系颜色变为天蓝色，而未反响的则为紫罗兰色，LAMP-HNB方法检测灵敏度为140cfu/mL，LAMP产物凝胶电泳结果与LAMP-HNB一样，PCR检测方法的检测灵敏度为1.4103cfu/mL1号空白反响管和8、9号反响管都为紫罗兰色，27号反响管为天蓝色。2.3.3人工污染副溶血弧菌的食品检测人
9、工污染副溶血弧菌的牡蛎样品中的菌液浓度为2.81072.8100CFU/mL。如表7和图16、17、18所示，人工污染副溶血弧菌的牡蛎样品LAMP方法的最低检出限为2.8102CFU/mL，平行PCR方法的检出限为2.8103CFU/mL。2.4市售海产品的实际检测对市售海产品40份分别进行LAMP-HNB检测、PCR检测和国标方法检测。其中LAMP-HNB法检出15份为阳性，25份为阴性，PCR检出15份为阳性25份为阴性，国标方法检出15份为阳性25份为阴性，检出率为38%。其中贝类的感染率最高，高达47%。以国标方法为标准，LAMP-HNB方法的检出率符合率为100%。3结论LAMP-H
10、NB方法用HNB判定反响结果，随着反响的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反响生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色，而未发生反响的体系则仍保持着紫罗兰色，以此判定LAMP反响结果。LAMP-HNB方法检测特异性强，对单增李斯特菌标准菌株等非副溶血弧菌的食源性致病菌行LAMP-HNB扩增反响，LAMP-HNB终反响体系为紫罗兰色，对副溶血弧菌标准菌株进行LAMP-HNB扩增反响，反响体系变为天蓝色，二者颜色差异明显，能够较为准确区分。LAMP-HNB方法检测灵敏度较高，对于基因组DNA的检测限约为108fg，细菌纯培养物检测限约为140cfu/mL，这与徐芊、程晓艳4等
11、报道采用LAMP检测结果基本相符，同时低于祝孺刚、刘琦等报道的采用PCR检测结果。LAMP反响经过产生大量的焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼直接观察，但较为难断定。常用的判定LAMP反响结果等方法有浊度分析、凝胶电泳和染料等。但是浊度分析和凝胶电泳法需要高昂设备和繁琐操作程序，所以研究新型指示剂观察反响结果在近几年较为流行。现常用的染料主要有SYBRgreen、钙黄绿素和HNB等。HNB和钙黄绿素能够在LAMP反响前参加，有效的减少了反响污染的可能性，其它染料如SYBRgreen则需要在反响后参加，加重了污染的可能性，若通过反响前将指示剂滴加在盖上，反响后弹入等方法则操作不容易控制。羟基萘酚蓝HNB是
12、一种金属离子指示剂，原理是镁离子与HNB结合使得反响体系初始颜色为紫罗兰色，随着反响的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反响生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色，而未反响的体系则仍保持着紫罗兰色，以此判定LAMP反响结果。本实验在反响前参加L反响浓度150mol/LHNB染料观察颜色变化断定反响结果，并同时将产物进行凝胶电泳，发现二者结果一样，此结果与聂凯等人报道的应用HNB检测甲型H1N1流感病毒，吕恒等人报道的应用HNB检测大肠埃希菌结果一样，证实HNB有较强的准确性。副溶血弧菌广泛的存在于海产品及沿海环境中，国内外的报道中副溶血弧菌的分离率高达68.12%和78.6%，不同类别的海产品感染率不同，其中贝类副溶血弧菌污染较为突出，最高可达75%，本文在几种海产品检验中也属贝类的感染率最高，能够到达50%。人们在购买海产品时要合理安排好贮藏温度和时间，防止穿插感染。在食用海产品时要尽量避免生食，要进行充分的热处理，隔夜的餐食食用前要充分加热，必要时能够加食醋调味杀菌。