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1、【精品文档】如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流烟草化学作业.精品文档. 烟草化学 姓 名：张一凡 学 号：SA13008064 院 系：生命科学学院 授课教师：刘少民第一题： 我来自生命科学学院，实验室研究方向主要为p53基因的功能及其与肿瘤的关系。我将从本题要求的第三点出发（进一步研究了化学成分与品质及危害性的关系），阐述烟草与p53基因突变及肿瘤形成关系，本实验室也可开展相关实验。 P53基因定位于人类第17号染色体的短臂，该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P531。野生型p53基因是肿瘤抑制基因，p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。p53基因突变后，由于其空间构象发
2、生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用，p53基因由抑癌基因转变为癌基因。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。当细胞暴露在一定的环境下，例如射线、化学致癌药物等，细胞受损，又不能得到修复，则p53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡中死去；有p53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂，致使细胞分裂不受控制，诱发肿瘤23。 吸烟与许多种癌症有关，如肺癌、口腔癌、舌癌、唇癌、鼻咽癌、喉癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、子宫颈癌等。有研究者分析了香烟中1500种不同的化学物质，发现其中不少化学物质既可以是致癌的启动剂，又可以是致癌的促进剂。近年来国外研究发现
3、肺癌病人中的p53基因突变的检测率都在50%左右4，日本学者还发现吸烟与非吸烟者肺癌患者中p53基因突变的检测率有明显的差异5。利用分子生物学技术聚合酶链式反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCR)以及本实验室的材料和实验器材，可以分析吸烟与非吸烟肺癌患者体内p53基因突变的检测频率，从p53抑癌基因的角度证明吸烟与肺癌的关系，使人们意识到吸烟的危害性。实验对象的选择为甲醛固定，石蜡包埋的肺癌组织标本（由实验室长期合作的医院提供）。然后将这些组织切成薄片，提取DNA，测定DNA浓度。选取合适引物，取部分样品分别扩增样本的p53基因。另外，再取DNA，选取32P标记的引物，同样进行PCR扩增。
4、PCR产物进行SDS电泳，做放射自显影。即可比较出p53的突变率。本实验室即可完成上述实验，比较结果。若吸烟肺癌患者p53突变率显著高于非吸烟肺癌患者的p53基因的突变率，则可在某种程度上说明吸烟可以促进肺癌发生率。参考文献：1 Lane DP，Crawford LV.T antigen is bound to a host protein inSV40-transformed cellsJNature，1979，278(5701)：2612692 Baker S J，Fearon ER，Nigo JM，et a1Chromosome 17 deletions and p53 gene mut
5、ations in colorectal carcinomaJScience， 1989,244(4901)：217-2213 Toledo F，wahl GMRegulating the p53 pathway；in vitro hypotheses，in vivo veritasJNat Rev Cancer，2006，6(12)：909-9234 Takahashi T, Nua MM, et al. Oncogene,1990,5:1603-16045 Suznki H, Takahashi T, et al.Cancer Ros,1992,52:734-736第二题 论烟草中氨基酸与
6、烟草品质及危害性关系的研究进展 烟叶的化学成分可分为两大类：一类为有机化合物，一类为无机化合物。糖、淀粉、糊精、纤维、色素、有机酸、蛋白质、烟碱、氨基酸等属有机化合物；氯、钾、磷、钙、镁、硫等无机盐类属无机化合物。根据所含化学元素，有机化合物又可分为两类：一类为含有碳、氢、氧元素的化合物，如糖、淀粉、纤维等，统称为碳水化合物；另一类除含有碳、氢、氧三种元素外还含有氮元素的化合物，如蛋白质、氨基酸、烟碱等，统称为含氮化合物。化学成分与烟叶质量的关系是个比较复杂的问题。氨基酸是烟草中主要的成分之一，它们与烟草的品质密切相关。游离氨基酸是烟叶中重要的化学成分，也是烟叶中的一类重要致香前体物质。氨基酸
7、的含量与烟草的品质有着密切的关系。其含量的高低直接影响烟的味道和烟气的丰满度。在烟叶的烘烤、陈化、调制及抽吸的过程中均会与烟叶中的还原糖发生美拉德反应而形成许多的重要制香成分12，故烟叶中游离的氨基酸种类的多少和含量的高低会直接影响烟叶的内在品质。在烟草调制、醇化或发酵、加工直至燃烧过程中游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物34，某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量与烟草制品的吃味有着密切的关系，氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，对烟气香
8、吃味产生不良影响，个别氨基酸还产生HCN等危害健康的烟气成分。一般说来，氨基酸含量太高，烟气辛辣、味苦、刺激性强烈；含量太低时烟气则平淡无味缺少丰满度。烤烟中的游离氨基酸既是蛋白质和烟碱合成的原材料，也是蛋白质和糖类生化转化反应的中间产物。氨基酸在赋予烤烟色香味方面具有双重作用：一方面，氨基酸在有氧条件下燃烧会生成氨，影响烟气质量：另一方面，在烤烟调制和醇化过程中，氨基酸会和糖类发生非酶棕化反应，主要是美拉德反应，形成大量具有烟草特征香味的挥发性化合物和大分子棕色化合物，如羰基化合物，呋喃化合物以及吡嗪类和吡咯衍生物等。它们不但赋予烟气烤焙香、坚果香和甜焦糖味，而且还使烟量感增加，尤其是呋喃类
9、成分，对烟气的香味有重要作用。此外，某些氨基酸可直接分解为香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等4。柴家荣5 等人也对不同品种白肋烟的游离氨基酸含量进行了研究，阐述了不同品种白肋烟香吃味与游离氨基酸的关系，表明如果白肋烟晾制21天后总游离氨基酸含量在1.5%-2.4%范围内，则属于优质白肋烟的范围。目前，感官评吸仍然是鉴定烟叶内在品质，尤其是香吃味的重要方法。而氨基酸与烟叶香吃味关系密切，是形成烟叶香气物质的前体，烟草中适量的氨基酸有助于提高烟气劲头和增加丰满度，若过量，则具有刺激性和苦味6。游离氨基酸狮是指以游离状态存在、未结合在蛋白质分子中的氨基酸。有研究对昆明地区红大C3F烟叶中游离氨基酸与感官
10、评吸指标之间的关系进行了主成分分析、偏相关分析及典型相关分析。偏相关分析表明，游离氨基酸组分与感官评吸大部分指标之间存在显著相关关系，其中精氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸对感官质量的贡献较大，缬氨酸对评吸的负面影响比较大一些7 。典型相关分析也表明，游离氨基酸与烟叶感官质量有显著相关性，且主要是由酪氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、浓度。香气量、劲头、丰富度、甜度、杂气和刺激的相关显著引起的7 。典型分析与偏相关分析均表明，在一定范围内提高甲硫氨酸、精氨酸、酪氨酸、甘氨酸、异亮氨酸含量，有利于改善烟草的抽吸品质。而这五种游离氨基酸在烟叶中的含量都比较低，说明游离氨基酸含量超出一定范围，反而会降低烟叶的抽
11、吸品质7 。氨基酸对于烟草香味物质的形成起着重要的作用8 。适量氨基酸有助于提高烟劲头和增加丰满度。若氨基酸含量太高，烟气辛辣，味苦，并且刺激性强烈。这是由于燃烧过程中氨基酸通常生成NH3等含氮化合物，个别氨基酸还产生HCN等危害性烟气成分；若氨基酸含量太低，烟气则平淡无味，缺少丰满度9。对愉悦性贡献较大的是：精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸；对丰富性贡献较大的是：丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸；对香气贡献较大的是：丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸；对浓度贡献较大的是：丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸；对劲头贡献较大的是：丙氨酸；对延绵性贡献较大的是：丝氨
12、酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸。此外，酪氨酸、甲硫氨酸与刺激呈显著正相关，表明随着这两种氨基酸含量的增加，刺激得分增加，刺激降低，对感官评吸有利。精氨酸、甲硫氨酸与杂气呈显著正相关，表明在一定范围内，精氨酸和甲硫氨酸含量越高，杂气得分越高，杂气越轻，对感官评吸有利。总游离氨基酸含量与丰富性，香气量，绵延性，浓度与评吸总分均呈显著或极显著正相关，表明游离氨基酸提高，有助于增加香气量，提升烟叶的丰富性，有利于提高烟叶抽吸品质。以上阐述了烟叶中游离氨基酸对烟叶品质的影响。众所周知，吸烟有害健康，吸烟为什么有害于健康，必须从烟草的化学组成、性质及其变化情况来考察。烟草的化学成分极为复杂，若按它们的
13、化学组成分类，可分为：碳水化合物、含氮化合物、有机酸、苷及多酚、脂肪、挥发油和树脂物、灰分元素。烟叶中含有许多含氮化合物，主要有：蛋白质、氨基酸和酰胺化合物、烟草生物碱。蛋白质是烟草植物体的主要营养物之一。烟叶中一般含蛋白质515，随蛋白质含量增加烟叶等级下降。蛋白质燃烧后会产生臭气，因此，烟叶中含蛋白质过多就使烟气质量低劣。烟草中含氨基酸、酚胺等虽然不多，但经燃烧以及烟叶加了过程都产生氨，对吸食的品质影响很大。烟叶中另一种含氮化合物，它有类似碱的性质，被称为烟草生物碱。各种烟草含烟草生物碱量差别很大，低的只含0.5以下，含量大的可达 10以上。烟草生物碱的存在，是烟草有别于其他植物的主要标志
14、。不含烟草生物碱的烟草植物，一般就能称为烟草。烟草生物碱以烟碱为主要成分，烟碱即尼古丁（Nicotine），约占全部烟草生物碱的95以上。我国卷烟用烟叶一般含烟碱2以下，含量超过3的很少见。烟草生物碱及其盐类具有强烈的水化作用，能在呈酸性反应条件下随水蒸气挥发出来。这样挥发出的游离态烟碱，量虽不多，但对烟叶吸食品质影响很大，易使成品吸味辛辣、呛喉。烟草之所以能成为人类最普遍之嗜好品，主要是由于它含有烟碱。当吸食烟草时，部分烟碱进入烟气，被人体器官吸收，吸入适量会使人感到兴奋。但烟碱毒性较大，吸入过量会引起头痛、呕吐等中毒症状。烟碱对心脏也有毒害。吸烟者的机能虽然逐渐习惯于这种毒性刺激，但仍然可
15、能会引起慢性中毒10。烟草制品在燃吸过程中，靠近火堆中心的温度可高达800900，由于燃烧而发生干馏作用和氧化分解等化学作用，使烟草中的各种化学成分都发生了不同程度的变化。有的成分被破坏，有的则又合成了新物质。其中各主要成分的变化大致如下。烟草生物碱：它在燃烧过程中除了一部分经干馏作用进入烟气之外，其中大部分（60%以上）则受氧化分解为亚硝胺、菸酸、吡啶、吡啉、吡咯、胺以及二氧化碳等物质；蛋白质：高分子含氮化合物经燃烧产生强烈氧化作用后，分解为一氧化碳、二氧化碳、硫化氢、氰氢酸、氨、简单胺化物及脂肪等化合物；糖和植物酸：糖和有机酸经氧化作用生成一氧化碳、二氧化碳、挥发酸、酚的衍生物、烯烃、醇、
16、醛和酮等物质；树脂物、多酚和苷类：经氧化后生成挥发性芳香油、醛、酮、醇和酸类物质。以上物质均进人烟气中，放烟草制品经燃烧后所产生的烟气，化学成分更为复杂。烟气中含有4万多种物质，目前已经鉴定出来的单体化学成分就达4200种之多，其中气相物质占烟气总量的90以上，粒相物质占9左右。气相物质中主要是氮气和氧气，其余为一氧化碳、二氧化碳、二氧化氮、二氧化氮、氨、挥发性N亚硝胺、氰化氢、挥发性碳水化合物以及挥发性烯烃、醇、醛、酮和烟碱等类物质。粒相物质中包括烟草生物碱、焦油和水分以及70多种金属和放射性元素。焦油是不挥发性N亚硝胺、芳香族胺、链烯、苯、萘、多环芳烃、N杂环烃、酚、羧酸等物质总的浓缩物。
17、在数千种烟气组分中，被认为对人体健康最为有害的是焦油、烟碱、一氧化碳、醛类等物质。 目前认为烟气中含有多种物质会促进肿瘤发生，尤其以肺癌最显著11。另外烟气中还含有多种有害物质，一氧化碳12 ：一经吸入即与血红蛋白结合，它与血红蛋白的化学亲和力比氧气达200倍以上，这样，由于减少了红细胞所携带氧的总量，一氧化碳能导致组织缺氧；苯：苯能引起神经衰弱、乏力、白细胞和血小板减少、贫血等症状，严重的可导致神志不清、肌肉痉挛等；挥发性醛和酮：这些挥发性羰基化合物特别是甲醛、丙烯醛及巴豆醛是纤毛的毒素，与氰化氢和氨一起，吸入后抑制了肺排泄物的清除，从而导致肺部疾病，甲醛还可诱发鼻癌；氧化氮类：主要对呼吸道
18、造成危害，可致急性中毒和慢性中毒。中毒症状主要是对黏膜组织的损害，如呼吸道炎症、咳嗽、咯血、支气管炎、肺炎和肺气肿等；氰化氢（HCN）是卷烟烟气中最具纤毛毒性的物质，它是几种呼吸酶的非常活跃的抑制剂。卷烟生产正面临划时代变革阶段。开发安全卷烟应该是今后充分考虑的可行途径。若能研制出既能防病又能治病的保健卷烟，则将是对人类健康最可贵的贡献。参考文献：1 刘百战，孙哲建，徐玉田.毛细管气象色谱法测定卷烟中的游离氨基酸J.中国烟草学报，1999,5（2）:1-5 2 李丹，黄龙，朱巍等.反相高效液相色谱法测定烟叶中游离的氨基酸J.烟草科技，2003,2:20-24 3 HECHT SS.Nitrog
19、enous compounds in cigarette and their possible precursorsJ.Rec Adv Tob Sci,1997,3:57-944 BURTON HR.Effect of curing on the chemical composition of burley tobaccosJ.Rec Adv Tob Sci,1983,9:91-1535 柴家荣，尚志强，字苹等.白肋烟品种间游离氨基酸含量变化规律初探J.云南农业大学学报，2004,19（1）：86-906 Okada，Y.Historical overview of research on t
20、he tobacco mosaic virus genome:genome organization, infectivity and gene manipulation J . Philos. Trans.R.Soc.land.Ser.Biol.Sci.1999,354:569-5827 邓国宾，曾晓鹰，薛红芬等.烤烟游离氨基酸与感官质量的相关性分析J.中国烟草科学，2011,10:14-238 王树声，杨德廉，王宝华等.烟草中氨基酸变化规律及其与烟叶品质关系研究进展J.中国烟草科学,1998,19,(3):11-139 肖协忠.烟草化学M.北京：中国农业科学出版社199710 谢玉文，黄素
21、辉.烟草特性及吸烟的危害J.化学教育，1990（5）：111 Takahashi T, Nua MM, et al. Oncogene,1990,5:1603-160412 金闻博，戴亚，杨俊编.烟草化学分析与烟气分析M.南昌：江西科技出版社，1993第三题 测定烟草中的吡啶类挥发性成分一、 【实验目的与意义】目的：1、掌握顶空共蒸馏法（HCD）分离烟草中吡啶类挥发性成分2、掌握气相定量质谱-色谱（GC-MS)法分析烟草中吡啶类挥发性成分。意义：进一步了解烟叶中化学成分，可以帮助分析其对健康产生的影响。二、 【实验原理】 烟草挥发性组分是一个复杂的体系。烟草中的化学组分很多，烟叶和烟气中化学成
22、分的总数达到5868种，其中烟叶特有成分1872种，烟气中特有成分2824种，烟叶和烟气共有的化学成分1172种。要从这么复杂的物质体系中把吡啶类挥发性物质分离和鉴定出来，定性定量分析，需要将多种方法结合起来。本实验采用顶空共蒸馏法（HCD）分离烟草中吡啶类挥发性成分。HCD法1是结合了顶空法和蒸馏法而产生的。首先是在1982年，Kim.K.R设计了顶空共蒸馏法分析烟叶样品，将烟末直接放入烧瓶中加水，加热使水沸腾，同时通入惰性气体（高纯度氮气），把与水共沸的挥发性物质带出。此方法集提取，蒸馏，顶空于一身，从而避免了三者的一些不足的地方，具有步骤简单，操作方便的优点。但在最初的使用中，由于烟叶中
23、的挥发性成分使用水提取的，所以提取率较低，提取的种类较少，提取出的物质明显不完全。李炎强2等人对该法进行了改进：先用二氯甲烷提取烟叶中的芳香类化合物，将其中的中性成分在通入惰性气体（高纯度氮气）的情况下，与水共沸，顶空蒸馏，把挥发性物质带出，达到分离的目的。实验证明，改进后的方法综合了水蒸气蒸馏、有机溶剂提取和顶空分离的优点，避免了一些各自的不足，重复性好，回收率高，操作简单，是烟草挥发性物质分离分析的一种较好的方法。 HCD方法对碱性挥发性物质表现出很高的灵敏度。几乎所有吡咯类、吡啶类、吡嗪类和生物碱类都能在HCD中检测到。 近几十年，由于色谱，红外光谱，核磁共振仪等检测仪器的迅速发展，我们
24、才能对烟叶的挥发性成分进行深入研究和了解。色谱具有高分辨率和灵敏度，一直是挥发性成分检测的标准技术。气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸 附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理 是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不
25、同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。本实验采用GC-MS连用仪对挥发性物质进行定性分析。三、 【实验方法】1. 吡啶类挥发性成分提取、分离方法：顶空共蒸馏法（HCD法）。HCD法是结合了顶空法和蒸馏法而产生的。首先是在1982年，Kim.K.R设计了顶空共蒸馏法分析烟叶样品，将烟末直接放入烧瓶中加水，加热使水沸腾，同时通入惰性气体（高纯度氮气），把与水共沸的挥发性物质带出。顶空共蒸馏法中，油浴温度是一个非常重要的参数。实验需比较不同油浴温度对提取挥发性成分的影响
26、。氮气流速直接影响着挥发性成分的提取效率，很容易随外界条件的变化而变化。在其他条件都相同的情况下，需要设置不同的氮气流速，使实验条件达到、最优化。2. 吡啶类挥发性成分的定性分析：定性过程利用Thermo.Finnigan TRACE GC 2000-TRACE DSQ,色谱-质谱联用仪进行定性分析34。初步定性是将未知挥发性物质的质谱图在Wiley库和NIST02库中物质的质朴图进行比较分析定性，并结合物质的结构和性质，进行多张谱图多次定性结果的综合定性；进一步的定性是将未知挥发性物质的质谱图和标准图进行比较定性。3. 吡啶类挥发性成分的定量分析：吡啶类挥发性成分定量使用内标法（振十七烷用作
27、挥发性成分的内标），结合色谱-质谱联用仪，设定所有物质的相对校正因子为1.00。标准物质的回收率测定，同样使用内标法。利用所有一直浓度的标准物质在同样的检测条件和程序升温条件下所求得的各物质的相对校正因子进行回收率的计算。四、 【实验仪器和设备】 烘箱、电热套、水浴锅、旋转蒸发仪、圆底蒸馏烧瓶；HP-6890GC色谱仪、HP-7683自动进样器、火焰离子化检测器（FID)、氮磷检测器（NPD），色谱-质谱联用仪（GC-MS联用仪）、毛细管柱HP-5MS、固定相为dimethyldiphneylsiloxane.五、 【实验步骤设计】（一）HCD法1. 将一定量的烟末置于平底烧瓶中，加入二氯甲烷
28、，振荡三小时2. 将其移入圆底蒸馏烧瓶中，加水，先通入氮气进行吹扫，待装置中空气吹净后，调节流速. 注意：氮气流速需要进行优化，选择效率最高的流速。3. 130油浴加热，同时用冷凝水作为初级冷凝，冰盐作为二级冷凝，收集馏出液，蒸馏三小时.4. 将两处收集将萃取液浓缩的液体混合，慢慢加盐至饱和，二氯甲烷萃取，合并兵保留萃取液。5. 最后将萃取液浓缩。（二） GC-MS定性定量分析1. 将未知挥发性物质的质谱图在Wiley库和NIST02库中物质的质朴图进行比较分析定性2. 使用内标法（振十七烷用作挥发性成分的内标），结合色谱-质谱联用仪，设定所有物质的相对校正因子为1.00。标准物质的回收率测定
29、，同样使用内标法。利用所有一直浓度的标准物质在同样的检测条件和程序升温条件下所求得的各物质的相对校正因子进行回收率的计算。主要参考文献：1 K.R.Kim,A.Zlatkis,J.W.Park,V.C.Lee,Isolation of essential oils from tobacco by gas co-distillation/solvent Extraction,Chromatographia,1982,15,559-563 2 李炎强，洗可法，顶空共蒸馏法分析烟草中性香味成分，中国烟草学报，1997,4 3 H.Y.Chung,J.Agric.Food.Chem,1999,49,22804 S.B.Stanfill,A.M.Calafat,C.R.Brown,G.M.Polzin, Concentrations of nine alkenylbenzenzenes coumarin,piperonaland pulegone in India bidi cigarette tobacco,Food and Chemical Toxicity 2003,41,303-317