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1、19 双水相萃取 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固- -液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pHpH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。 由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。 因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。 双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连
2、续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2 25 5倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。 双水相萃取法和传统的分离方法( (如盐析或有机溶剂沉淀等) )相比也有很大的优势，如以-半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃取纯化的比较见下表。 除此以外，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法,设备需用量要少310倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。 用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，-半乳糖苷酶的提取也到了中
3、试规模等。19.1 双水相的形成 亲水性的聚合物溶液 熵增混合自发 分子间作用力-随着Mr的增加,而增大. 聚合物的不相容性-含有聚合物分子的溶液发生分相的现象. 聚合物的不相溶性(incompatibility)： 当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。 19.1 19.1 双水相系统双水相的形成1. 如两种聚合物间存在强的吸引力，则它们结合后存在于如两种聚合
4、物间存在强的吸引力，则它们结合后存在于一相中；如两种聚合物间有斥力，即某种分子希望在它一相中；如两种聚合物间有斥力，即某种分子希望在它周围的分子是同种分子而不是异种分子，达到平衡后会周围的分子是同种分子而不是异种分子，达到平衡后会形成两相，两种聚合物分处一相。形成两相，两种聚合物分处一相。2. 加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。两相。常用聚合物：聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇无机盐系统无毒原则19.1 双水相的形成双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS) PEG = 聚已二醇(polyethylene
5、 glycol)Kpi = 磷酸钾DX = 葡聚糖(dextran)1、Pro如何分布2、影响因素3、应用19.2 ATPS相图 相图:相平衡时物系的组成,温度与压力的关系.双节线：图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线：双节线上两点的直线。双节线均相区两相区系线临界点系线反映的信息系线反映的信息A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则杠杆定律 概述两水相萃取系线反映的信息系线反映的信息B 性质差异： 系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.C临界点： 当系线长度趋于零
6、时, 两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K点。两水相萃取 19.3 分配理论 表面自由能的影响 表面电荷的影响 双水相萃取过程的理论基础两水相萃取两水相萃取19.3 蛋白质的分配平衡 1)分配系数m2)m贡献因子me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献. 非电解质型溶质: :电中性蛋白质的m m0 0： 式中, , M M : : 溶质分子量; ; : : 溶质在上下两相表面自由能的差, J/mol, J/mol。意义：A A 不受静电作用的影响( (因不带电););B B 一般 0 0，不同溶质lnlnm m 随M M 而 ；C C ATPSATPS不同, ,
7、 同一溶质的也就不同，m m 随ATPSATPS不同而改变。 图是不同propro在pHpH为各propro的pIpI的ATPSATPS中的m, m, 3)、静电作用道南电位(,) 实际ATPS中有电解质, 当这些离子在两相中m 1), 将两相间产生电位差 带电pro的m:意义：A荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比.B 由于同一ATPS中添加不同的盐产生的不同,故m与Zpro的关系因盐而异。4)疏水作用疏水作用 相间疏水因子(HF,)PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相)疏水性较大,相间的疏水性用HF表示. HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:RH
8、-aaaa相对疏水性 是通过测定aaaa在水和已醇中溶解度的差别确定的, ,并设疏水性最小的GlyGly的RH=0.RH=0.所以, ,上式中的B B为: :mGly为Gly分配系数. 所以, pH=pL时aa在ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关系,直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图为测定实例.Pro表面疏水性(HFS, 利用上式可确定不同ATPS的HF值.如在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋白质的HFS 图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增大而增大。将盐对pro的HF影响上式得： 其
9、中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。因此，m的一般形式 19.4 影响蛋白质m的综合因素1)成相聚合物浓度和分子量分子量M : 若降低聚合物的M，则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统，若降低DX的M，则m减小。这一规律具有普遍意义。成相系统的总浓度：增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相.存在问题： 当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附.这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时
10、尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质.这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑。2)盐：图为各种离子在PEF/DX系统中的m. 图示：HPO42-和H2PO4-(H1.5PO4-1.5)离子在PEG/DX系统的m小, 因此利用pH 7的磷酸盐很容易改变,使带负电pro有较高的m.HFS：盐的种类和浓度影响pro的HFS, 从而影响pro的m。当盐的浓度很大时(如1mol/dm3), 由于强烈的盐析，蛋白质的溶解度达到极限，表现分配系数增大，此时m与pro浓度有关。利用这一特点，通过调节ATPS盐浓度，可选择性萃取不同的pro。不良影响：改变各相中成相物
11、质的组成和相体积比。如PEG/Kpi系统中上、下相(或称轻重组)的PEG和磷钾浓度。3)、pH valueA(pH pI) valuepro(Z)lnmB 交错分配法 当加入不同种类的盐时，由于相间电位不同，lnmpH关系曲线也不一样。但在pro的pI处，由于Z=0，m应相同，即两条关系曲线交于一点。所以, 通过 测 定 不 同 盐 类 存 在 下 lnmpH曲线的交点,可测定蛋白质细胞器以及微粒的pI。CpH影响磷酸盐解离： 即影响PEG/Kpi系统的相间电位和蛋白质的分配系数。对某些pro, pH的很小变化会使m改变23个数量级。4) 温度 温度影响小, 一般温度改变不影响产物的萃取。 大
12、规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于：(1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性;(2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离;(3) 常温操作节省冷却费用.体系的选择和优化1）体系选择的原则：基本公式：根据目标pro和共存杂质的HFSMpIZ等的差别, 综合利用静电、疏水和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。若目标产物与杂蛋白的表面疏水性HFS相差较大，充分发挥盐析作用；提高成相系统的浓度(系线长度)，增大ATPS的HF，也是选择性萃取的重要手段。 改变系线长度还可以使细胞碎片选择性分配与于PEG/盐系统的下相；采用M较大的PEG可降低pro的m，使萃取
13、到PEG相的pro总量减少，从而提高目标蛋白质的选择性。 例如，采用6.3%PEG6000/10%Kpi系统,可从细胞匀浆液中将半乳酸糖苷提纯12倍,而使用低分子量PEG时,萃取的选择性降低17.此外,在磷酸盐存在下于pH7的范围内调节pH也可提高目标产物的萃取选择性. 在上述理论基础上,设计合理的试验,可确定最佳萃取系统. 双水相萃取放大容易: 一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模. 因此,常利用多组10ml刻度离心管,进行分配平衡实验. 具体实验步骤如下.(1) 配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相, 每个双水相改变一个参数. 其中pH通常用磷酸盐缓冲液或氨酸调节. (2
14、) 加入料液, 再加水使整个系统质量达到510g.离心管封口后充分混合;(3) 在18002000g下离心35min,使两相完全分离;(4) 小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出,测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性, 计算分配系数. 上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差。 19.5应用1) 蛋白质、酶的纯化2) 多肽的分离纯化3) 核酸的分离纯化4)、病毒、细胞、细胞器的分离 反胶束萃取反胶束萃取 （反胶团萃取）（反胶团萃取）1基本术语基本术语胶束(micelles): 向水中加入表面活性剂，水溶液的表面张力
15、随S增大而下降。当S达到一定值后，S缔合形成水溶性胶束, 溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。胶团形成均是S分子自聚集的结果，是热力学稳定体系。自组装(self-assembly): 自动有序聚集的过程临 界 胶 束 浓 度 ( c r i t i c a l m i c e l l e concentration,CMC): S在水溶剂中形成胶束的最低浓度。 反胶束(reverse micelles): 若向有机溶剂中加入一定浓度S，在有机溶剂中所会形成胶束。当形成反胶束时，水在有机相中的溶解随S线性增大。因此，可通过测定有机相中平衡水浓度的变化，确定形成反胶团的最低表面活性剂浓
16、度。 反胶束的形态：球形或近似球形，也呈柱状。 极性核(polar core): S分子的自组装形成了极性核。 微水相或“水池”(water pool)：反胶束内溶解的水。 2基本性质内水池直径d d：反胶束的大小与溶剂和S S的种类与浓度、温度、I I等因素有关，一般为5-20nm5-20nm，d d用下式计算：W W0 0- -有机相中水与S S的摩尔比，又称为含水率(water content)(water content)；M-M-水分子质量；a asurfsurf- -界面处一个S S的面积；N-N-阿弗加德罗常数。内水的性质：当W W0 0较低 ( (如S = AOT, WS =
17、AOT, W0 0 = 6-8) = 6-8)时, , 微水相的水分子受S S亲水基团的强烈束缚, , 表观粘度上升5050倍, , 疏水性也极高。随W W0 0的增大, , 这些现象逐渐减弱, , 当 W W0 01616时, , 微水相的水与正常的水接近, , 反胶团内可形成双电层。但即使当W W0 0值很大, , 水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同, , 特别是在接近S S亲水头的区域内。 AOTAOT反胶团直径d dAOT: AOT: 常用于制备反胶束的S S是二- -(2-(2-已基已基) )琥珀酸酯磺酸钠, ,商品名为Aerosol OT, Aerosol OT, 即AOT
18、AOT。其在异辛烷中形成反胶团d dAOT: AOT: 第1 1项为水核直径，第二项(2(2* *1.2 nm)1.2 nm)为二倍AOTAOT分子长度. . 一般反胶团的W0W0不超过40. 40. 因此, , 依据上式, , 利用ATOATO形成的水核直径一般不超过12nm, 12nm, 大致可容纳一个直径为5-10nm5-10nm的propro分子. . 当propro分子比与反胶团直径相比大得多时( (如, ,当M 100-200kD),M 100-200kD),难于溶解到反胶团中. .3反胶束的溶解作用微水池溶解和分离作用：反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子, 为生
19、物分子提供易于生存的亲水微环境. 因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。蛋白质溶解模型：a、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；b、半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触；c、pro吸附于反胶团内壁；d、pro疏水区与几个反胶团的S疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。3反胶束的溶解作用溶解推动力A静电作用：理论上, ,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时, ,由于静电引力的作用, ,溶质易溶于反胶团, ,溶解率或分配系数较大, ,反之, ,则不能溶解到反胶团相中, ,左图为pHpH值对不同蛋
20、白质的 溶 解 率 急 剧 变 化 , , 当pH ,pH ,即在带正电荷的pHpH范围内蛋白质的溶解率接近100%,100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。3反胶束的溶解作用B B空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, , 含水率W W0 0随盐浓度的增大而降低, ,反胶团直径减小, , 空间排阻作用增大, pro, pro溶解下降. . 如，AOT/AOT/异辛烷系统的含水率与I I-0.5-0.5成正比。图中W W0 0与NaClNaCl浓度关系为: :图还示：AOT/AOT/异辛烷系统的含水率与AOTAOT浓度无关, ,这是多数反胶团系统的共性. .在各p
21、ropro的pIpI处( (排除了静电相互作用的影响) )，反胶团萃取实验研究表明: : 随着M M增大, pro, pro的分配系数(m, (m, 溶解率) )下降。当M 20KDM 20KD时, m, m很小. . 表明随M M增大, , 空间排阻作用增大, pro, pro的溶解率降低. . 图的结果还表明, , 要据propro间M M的差别可以选择性对propro进行萃取分离。C疏水性相互作用aaaa的疏水性各不相同, , 研究表明, ,除pHpH和I I外, aa, aa或肽的m m随aaaa疏水性的增大而增大3939. .蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式, ,因而影响其分
22、配系数. . 疏水性较大的propro可能以“半岛式”形式溶解。D分配系数m(or K):4反胶束萃取的操作A萃取的基本方法B 反萃取 . C 分级萃取5反胶束萃取的影响因素1) pH valueAOT = 二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。2)盐浓度盐浓度W0S&Pro Z选择性3)、盐离子的种类4) 蛋白质分子量M5)、表面活性剂SA种类BS6) 助表面活性剂6应用1) 蛋白质分离6应用2) 胞内酶的提取3) 蛋白质复性( protein refolding )思考题19.3 蛋白质的分配平衡 1)分配系数m2)m贡献因子me、mb和ma分别为静电、疏水和亲和作用对溶质m的贡献. Pro
23、表面疏水性(HFS, 利用上式可确定不同ATPS的HF值.如在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋白质的HFS 图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增大而增大。将盐对pro的HF影响上式得： 其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。因此，m的一般形式 19.4 影响蛋白质m的综合因素1)成相聚合物浓度和分子量分子量M : 若降低聚合物的M，则pro分配于富含该聚合物的相中。如PEG/DX系统，若降低DX的M，则m减小。这一规律具有普遍意义。成相系统的总浓度：增大时,系统远离临界点,系线长度增
24、加,两相性质的差别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1),即大于1或小于1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相.4) 温度 温度影响小, 一般温度改变不影响产物的萃取。 大规模操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于：(1) 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性;(2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离;(3) 常温操作节省冷却费用. AOTAOT反胶团直径d dAOT: AOT: 常用于制备反胶束的S S是二- -(2-(2-已基已基) )琥珀酸酯磺酸钠, ,商品名为Aerosol OT, Aerosol O
25、T, 即AOTAOT。其在异辛烷中形成反胶团d dAOT: AOT: 第1 1项为水核直径，第二项(2(2* *1.2 nm)1.2 nm)为二倍AOTAOT分子长度. . 一般反胶团的W0W0不超过40. 40. 因此, , 依据上式, , 利用ATOATO形成的水核直径一般不超过12nm, 12nm, 大致可容纳一个直径为5-10nm5-10nm的propro分子. . 当propro分子比与反胶团直径相比大得多时( (如, ,当M 100-200kD),M 100-200kD),难于溶解到反胶团中. .4反胶束萃取的操作A萃取的基本方法B 反萃取 . C 分级萃取5)、表面活性剂SA种类BS6) 助表面活性剂