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1、微生物培养基的配制和微生物培养基的配制和灭菌及纯培养灭菌及纯培养一、微生物培养基的配制和灭菌一、微生物培养基的配制和灭菌（不做）（不做）目的要求目的要求实验材料实验材料实验程序实验程序1、目、目 的的了解培养基的配制原理和方法，掌握其了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。配制过程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。2、材、材 料料 和和 器器 皿皿主要药品主要药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、营养琼脂等营养琼脂等。仪器仪器：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱
2、、：高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、紫外线杀菌灯。紫外线杀菌灯。其它其它：天平、药匙、电炉、：天平、药匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、三角烧瓶、量筒、玻棒、试纸、三角烧瓶、量筒、玻棒、试管、培养皿、吸管、牛皮纸、纱绳、硅胶试管、培养皿、吸管、牛皮纸、纱绳、硅胶塞、标签等。塞、标签等。3、方法和步骤、方法和步骤培养基的配制培养基的配制培养基和玻璃器材的灭菌方法培养基和玻璃器材的灭菌方法培养基的概念及种类培养基的概念及种类培养基的配方、配制步骤培养基的配方、配制步骤（1）培养基的配制）培养基的配制培养基培养基 是指由人工配制的、适合微生物生长是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或
3、产生代谢产物用的混合营养料。繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。培养基的介绍培养基的介绍碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水营养物质的浓度要适宜营养物质的浓度要适宜营养物质之间的配比要适宜营养物质之间的配比要适宜培养基的培养基的pH值、渗透压、值、渗透压、水活度和氧化还原电势等水活度和氧化还原电势等物理化学条件要适宜。物理化学条件要适宜。细菌：细菌： pH 7.08.0放线菌：放线菌：pH 7.58.5酵母菌：酵母菌： pH 3.86.0霉菌：霉菌：pH 4.05.8藻类：藻类： pH 6.07.0原生动物：原生动物： pH 6.08.0初始初始pHpH通
4、常培养条件：通常培养条件：培养基的种类培养基的种类按照培养基的物理状态可分为按照培养基的物理状态可分为 1.1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.2.固体培养基：在液体培养基中加入固体培养基：在液体培养基中加入2%2%左右的凝固剂的左右的凝固剂的固体状态的培养基。固体状态的培养基。 3.3.半固体培养基：在液体培养基中加入半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.20.5%0.5%凝固凝固剂而成的半固体状培养基。剂而成的半固体状培养基。 琼脂是最优良的凝固剂，自琼脂是最优良的凝固剂，自18801880年代开始用于配制年代开始用于配制微生物培养
5、基以来，至今经久不衰。微生物培养基以来，至今经久不衰。实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌： 查氏合成培养基；查氏合成培养基；培养基的配制培养基的配制配方、配料配方、配料加热溶解加热溶解调调pH(pH(略略) )过滤（略）过滤（略）分装分装( (倒平板不分装）倒平板不分装）灭菌灭菌包扎包扎( (试管放在烧杯试管放在烧杯) )摆斜面、倒平板摆斜面、倒平板贮存贮存牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制1、液体培养
6、基、液体培养基2、固体培养基、固体培养基3、半固体培养基、半固体培养基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨固体固体培养基配方培养基配方(P.78)：牛肉膏牛肉膏 0.3g 蛋白胨蛋白胨 1g 氯化钠氯化钠 0.5g 琼脂琼脂 1.5g 水水 100mL pH 7.27.4 灭菌灭菌 121，20min牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨半固体半固体培养基配方：培养基配方： 琼脂琼脂 0.3g牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨液体液体培养基配方：培养基配方： 琼脂琼脂 0g牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨营养琼脂：营养琼脂：按照配方生产的牛肉膏蛋白胨培养基，属于固体培养基。按照配方生产的牛肉膏蛋白胨培养基，属于固体培养基。今天固体培养基
7、用营养琼脂。今天固体培养基用营养琼脂。液体培养基和半固体培养基按照上述配方称量。液体培养基和半固体培养基按照上述配方称量。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。用高压蒸汽灭菌。常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。药品灭菌等方法。本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽本实验培养基的灭菌
8、常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空气使菌体蛋白灭菌，它是利用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。质凝固变性而达到灭菌的。P.90 （2）培养基和玻璃器材的灭菌方法）培养基和玻璃器材的灭菌方法高压蒸气灭菌高压蒸气灭菌 一般培养基一般培养基: 121.3, 15-30 min 含糖培养基含糖培养基: 112.6 , 15-30 min 培养基的灭菌培养基的灭菌器皿的灭菌：器皿的灭菌： 干热空气：干热空气： 160， 2 小时小时无菌室的消毒：无菌室的消毒： 紫外光紫外光 化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）甲醛）1、实验目的、实验目的1）掌握常用的分离
9、纯化微生物的基本操）掌握常用的分离纯化微生物的基本操作技术：作技术：平板划线法；平板划线法；2）掌握微生物无菌操作技术；）掌握微生物无菌操作技术；3）熟悉不同微生物在固体斜面、半固体）熟悉不同微生物在固体斜面、半固体和液体培养基上的生长特征。和液体培养基上的生长特征。1） 微生物在自然界中无处不在，尤其微生物在自然界中无处不在，尤其在土壤中存在极其丰富。但自然界中的在土壤中存在极其丰富。但自然界中的微生物都以混杂状态存在。要研究某种微生物都以混杂状态存在。要研究某种微生物的性质，首先要获得这种微生物微生物的性质，首先要获得这种微生物的纯培养物。的纯培养物。2）在固体平板、固体斜面、半固体和）在
10、固体平板、固体斜面、半固体和液体培养基上，不同的微生物有其固有液体培养基上，不同的微生物有其固有的培养特征。这些培养特征可以作为微的培养特征。这些培养特征可以作为微生物分类鉴定的指标。生物分类鉴定的指标。今天接种的菌种：今天接种的菌种：l枯草杆菌枯草杆菌 芽孢杆菌属的一种。单个细胞芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.70.823微微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动能运动。 菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。广泛分布在需氧菌。广泛分布在土壤及腐败的有机物
11、中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 l大肠杆菌大肠杆菌 需氧及兼性厌氧。需氧及兼性厌氧。G短杆菌，周鞭毛，短杆菌，周鞭毛，有动力有动力，周身有菌毛。，周身有菌毛。l变形杆菌变形杆菌 为革兰氏染色阴性、无芽胞、无荚膜、周身鞭毛、为革兰氏染色阴性、无芽胞、无荚膜、周身鞭毛、运动活泼运动活泼、两端钝圆的小杆菌。兼性厌氧。有些种在两端钝圆的小杆菌。兼性厌氧。有些种在普通固体培养基上菌落呈迁徙生长。普通固体培养基上菌落呈迁徙生长。 在自然界中存在极广，水、泥土、阴沟及各种腐在自然界中存在极广，水、泥土、阴沟及各种腐败的动、植物中最多，也存在于健康人和动物的肠道
12、败的动、植物中最多，也存在于健康人和动物的肠道中。它们是条件致病菌，在特殊情况下对人致病，如中。它们是条件致病菌，在特殊情况下对人致病，如食物中毒、尿路感染、夏季腹泻或其他混合感染。食物中毒、尿路感染、夏季腹泻或其他混合感染。 l葡萄球菌葡萄球菌 是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，是一群革兰氏阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状，故名。在液体培养基的幼期培养中，常常分散，细菌故名。在液体培养基的幼期培养中，常常分散，细菌细胞单独存在。代表种有金黄色葡萄球菌（细胞单独存在。代表种有金黄色葡萄球菌（S-taphylococcusaureus）（黄色）、白色葡萄球菌）（黄色）、白色葡萄球菌（Salb
13、us）（白色）、柠檬色葡萄球菌）（白色）、柠檬色葡萄球菌（Scitreus）（橙色）。）（橙色）。 葡萄球菌无鞭毛，葡萄球菌无鞭毛，不能运动不能运动。无芽胞，除少数菌。无芽胞，除少数菌株外一般不形成荚膜。株外一般不形成荚膜。 在肉汤培养基中在肉汤培养基中24小时后呈均匀混浊生长，在琼小时后呈均匀混浊生长，在琼脂平板上形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，脂平板上形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落。不同种的菌标产生不同的色素，如金不透明的菌落。不同种的菌标产生不同的色素，如金黄色、白色、柠檬色。黄色、白色、柠檬色。 3、实验操作、实验操作（1）接种）接种l每组每人固体平板、试
14、管斜面、半固体、液体每组每人固体平板、试管斜面、半固体、液体培养基各培养基各1个。个。l每组每组1人接种枯草杆菌，人接种枯草杆菌，1人接种大肠杆菌，人接种大肠杆菌，1人接种变形杆菌，人接种变形杆菌，1人接种白色葡萄球菌。人接种白色葡萄球菌。l写上自己的班级、学号、菌名。写上自己的班级、学号、菌名。平板接种方法参阅平板接种方法参阅p.129；斜面接种方法参阅斜面接种方法参阅p.8；液体接种方法参阅液体接种方法参阅p.99；半固体接种参阅半固体接种参阅P.49。（2）培养特征观察）培养特征观察l于于37下培养下培养24h后观察各种菌株在不同的培养基上后观察各种菌株在不同的培养基上的培养特征，比较它
15、们培养特征之间的差异。的培养特征，比较它们培养特征之间的差异。l平板培养特征的描述参阅平板培养特征的描述参阅p.18表表2，斜面培养特征参，斜面培养特征参阅阅P.9，液体培养特征的描述参阅，液体培养特征的描述参阅P.100，半固体培养，半固体培养特征的描述参阅特征的描述参阅P.49-50。l明天中午明天中午12:30观察结果并记录。观察结果并记录。思考题：思考题：1.某人将培养了某人将培养了5天的革兰氏阳性菌进行革兰氏染色，天的革兰氏阳性菌进行革兰氏染色，他很奇怪地发现在油镜下细菌显红色。这是怎么回他很奇怪地发现在油镜下细菌显红色。这是怎么回事？事？2.张三将已知革兰氏阳性菌和另一株革兰氏阴性菌放张三将已知革兰氏阳性菌和另一株革兰氏阴性菌放在相邻位置进行革兰氏染色，不巧的是他忘记加碘在相邻位置进行革兰氏染色，不巧的是他忘记加碘液这一步。在油镜下观察他的玻片时，你认为他会液这一步。在油镜下观察他的玻片时，你认为他会看到什么？为什么？看到什么？为什么？