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1、北科大微生物培养基的配制及灭菌第一页，讲稿共二十二页哦肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基是是一一种种广广泛泛用用于于培培养养细细菌菌的的培培养养基基，属属 于于 天天 然然 培培 养养 基基（complex media,undefined media）。其其主主要要成成分分是是牛牛肉肉膏膏、蛋蛋白白胨胨和和NaCl。它它们们分分别别提提供供微微生生物物生生长长繁繁殖殖所所需需要要的的碳碳源源、氮氮源源、能源、生长因子和无机盐等。能源、生长因子和无机盐等。配配天天然然培培养养基基时时可可以以用用自自来来水水，但但自自来来水水中中常常含含Ca2，Mg2离子，可与其他成分形成沉淀离子，可与其他成分形成
2、沉淀。肉膏蛋白胨培养基肉膏蛋白胨培养基第二页，讲稿共二十二页哦高高氏氏合合成成一一号号培培养养基基是是一一种种用用于于培培养养放放线线菌菌的的合合成成培培养养基基(defined media)。培培养养基基中中的的可可溶溶性性淀淀粉粉作作为为碳碳源源和和能能源源，KNO3作作为为氮氮源源，K2HPO4、MgSO4和和FeSO4作作为为无无机机盐盐（高高价价阳阳离离子子盐盐需需单单独独灭灭菌菌后后临临用用前前与与含含磷磷酸酸盐盐的的培培养养基混匀基混匀）。）。合成培养基必须用蒸馏水合成培养基必须用蒸馏水高氏合成一号培养基高氏合成一号培养基第三页，讲稿共二十二页哦豆豆芽芽汁汁葡葡萄萄糖糖培培养养基
3、基是是培培养养酵酵母母菌菌及及霉霉菌菌的的一一种种优优良良培培养养基基，为为半半合合成成培培养养基基(semi-defined media)。培培养养基基配配方方出出现现的的自自然然pH系系指指培培养养基基不不经经酸酸、碱碱调调节节而而自自然然呈呈现现的的pH。豆芽汁葡萄糖培养基豆芽汁葡萄糖培养基第四页，讲稿共二十二页哦马马丁丁培培养养基基是是选选择择培培养养基基，属属于于半半合合成成培培养养基基，常常用用于于从从自自然然环环境境中中分分离离真真菌菌，其其中中的的孟孟加加拉拉红红能能抑抑制细菌和放线菌的生长，而对于真菌的生长则没有影响，制细菌和放线菌的生长，而对于真菌的生长则没有影响，另另外外
4、，在在使使用用前前，向向培培养养基基中中加加入入去去氧氧胆胆酸酸钠钠和和链链霉霉素素(30u/ml)。去去氧氧胆胆酸酸钠钠为为表表面面活活性性剂剂，防防止止霉霉菌菌菌菌丝丝蔓蔓延延，还还可可抑抑制制G+细细菌菌生生长长；链链霉霉素素对对多多数数G 细菌具抑制生长作用。从而达到分离真菌的目的。细菌具抑制生长作用。从而达到分离真菌的目的。马丁培养基马丁培养基第五页，讲稿共二十二页哦产葡萄糖氧化酶菌株的筛选培养基产葡萄糖氧化酶菌株的筛选培养基葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，E.C.1.1.3.4，简称，简称GOD）O2+C6H12O6+H2O C6H12O7+H2O2 GO
5、D葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化酶在生化检测（葡萄生化检测（葡萄糖）、面粉处理糖）、面粉处理（过氧化氢对半（过氧化氢对半胱氨酸的作用形胱氨酸的作用形成二硫键）、食成二硫键）、食品保鲜（去除氧品保鲜（去除氧气）等领域具有气）等领域具有广泛应用广泛应用。第六页，讲稿共二十二页哦培养基培养基葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶平板筛选培养基平板筛选培养基(gL-1)：葡葡萄萄糖糖80，蛋蛋白白胨胨3，(NH4)2HPO4 0.39，KH2PO4 0.19，MgSO47H2O 0.16，CaCO3 3.5，可可溶溶性性淀淀粉粉10，KI 1.7，脱脱氧氧胆胆酸酸钠钠0.2，琼琼脂脂20，硫硫酸酸
6、链链霉霉素素25000U。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶第七页，讲稿共二十二页哦产葡萄糖氧化酶的微生物大多为霉菌。产葡萄糖氧化酶的微生物大多为霉菌。加入脱氧胆酸钠是为了抑制菌丝的形成加入脱氧胆酸钠是为了抑制菌丝的形成以获得不互相粘连的霉菌菌落。加入硫以获得不互相粘连的霉菌菌落。加入硫酸链霉素是为了抑制细菌的生长。葡萄酸链霉素是为了抑制细菌的生长。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖会生成葡萄糖酸，糖氧化酶催化葡萄糖会生成葡萄糖酸，pH下降，可以通过下降，可以通过CaCO3控制培养基的控制培养基的pH，并形成透明圈。葡萄糖氧化酶催化，并形成透明圈。葡萄糖氧化酶催化葡萄糖会生成过氧化氢，可以氧化葡萄糖会生成过氧化氢，
7、可以氧化KI生成生成I，使淀粉变色，从菌落周围是否出现特异的，使淀粉变色，从菌落周围是否出现特异的淀粉蓝色圈可以判断出该菌是否产酶。淀粉蓝色圈可以判断出该菌是否产酶。第八页，讲稿共二十二页哦培养方法培养方法葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶土土壤壤霉霉菌菌分分离离：取取土土壤壤样样品品5g，加加入入95mL的的无无菌菌水水中中，200rmin-1摇床振荡摇床振荡 1h。平平板板筛筛选选培培养养：采采用用Fiedure.K.J显显色色法法。将将富富集集培培养养后后的的土土壤壤悬悬液液，按按不不同同稀稀释释度度（10-2、10-3、10-4）接接种种于于平平板板筛筛选选培培养基，养基，28培养培养3d。斜斜
8、面面培培养养：挑挑取取平平板板培培养养基基中中蓝蓝色色圈圈较较大大的的菌菌株株接接种种至至斜斜面面培培养基，养基，28恒温，培养恒温，培养4d后置于后置于4冰箱保存备用。冰箱保存备用。摇摇床床培培养养：接接种种斜斜面面保保存存的的菌菌种种于于发发酵酵培培养养基基，250mL摇摇瓶瓶50mL装装液液量，量，28恒温，恒温，200rmin-1旋转摇床，培养旋转摇床，培养2d。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶第九页，讲稿共二十二页哦实验材料实验材料药药品品：牛牛肉肉膏膏、蛋蛋白白胨胨、NaCl、马马铃铃薯薯、蔗蔗糖糖、KNO3、K2HPO4、MgSO47H2O、FeSO47H2O、可可溶溶性性淀淀粉粉、葡葡
9、萄萄糖糖，(NH4)2HPO4、KH2PO4、CaCO3、KI、脱脱氧氧胆胆酸酸钠钠、硫硫酸酸链链霉霉素素、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、琼琼脂脂等等各各种种培培养养基基的的组组成成成成分分、0.1孟孟加加拉拉红红溶液，溶液，l mol/L HCl、l mol/L NaOH。高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌器器、电电热热恒恒温温干干燥燥箱箱、紫紫外外线线杀杀菌菌灯灯、电电炉炉、天平天平 其其它它：酒酒精精灯灯、试试管管、称称量量纸纸、牛牛角角匙匙、烧烧杯杯、量量筒筒、玻玻棒棒、pH试试纸纸、玻玻璃璃珠珠、三三角角瓶瓶、封封口口膜膜、无无棉棉塞塞的的空空试试管管、培培养养皿皿、各种包装纸、防
10、水纸、绳索、棉花、记号笔、标签等。各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、记号笔、标签等。准准备备无无菌菌水水，去去离离子子水水装装于于250ml三三角角瓶瓶中中，每每瓶瓶95ml，放放置置3-5颗玻璃珠，颗玻璃珠，121灭菌灭菌30min。第十页，讲稿共二十二页哦实验内容实验内容（玻璃器皿的洗涤和包装）（玻璃器皿的洗涤和包装）1玻璃器皿的洗涤玻璃器皿的洗涤2灭菌前玻璃器皿的包装灭菌前玻璃器皿的包装(1)培养皿的包装培养皿的包装(2)三角瓶的包装三角瓶的包装第十一页，讲稿共二十二页哦过滤除菌过滤除菌抗生素等不耐热物质需要进行过滤除菌。抗生素等不耐热物质需要进行过滤除菌。滤器和容器等一般需要进行高温灭菌
11、。滤器和容器等一般需要进行高温灭菌。第十二页，讲稿共二十二页哦实验内容实验内容（液体及固体培养基的配制过程）（液体及固体培养基的配制过程）1.称称量量：按按照照配配方方正正确确称称取取各各种种原原料料（除除琼琼脂脂外外）放放于于有有刻刻度度的的烧杯中。烧杯中。2.溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅拌，加热溶解。溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅拌，加热溶解。3.定容：定容：倒入一量筒中，补水至所需体积倒入一量筒中，补水至所需体积。4.调调pH值值：滴滴加加1mol/L NaOH或或1mol/L HCl调调至至所所需需pH，用用pH试纸对照试纸对照。液体培养基配制完成！液体培养基配制完成！5.加
12、加琼琼脂脂混混匀匀：趁趁热热加加入入1.5的的琼琼脂脂搅搅匀匀。固固体体培培养养基基配配制制完成！完成！第十三页，讲稿共二十二页哦如果培养基中某种药品用量太少，可以如果培养基中某种药品用量太少，可以将其配制成较浓的溶液，然后按比例吸将其配制成较浓的溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。取一定体积溶液，加入至培养基中。固体培养基的配制：可以在配制好的液固体培养基的配制：可以在配制好的液体培养基中加入适量的琼脂粉，灭菌。体培养基中加入适量的琼脂粉，灭菌。未冷却前取出，摇匀。未冷却前取出，摇匀。第十四页，讲稿共二十二页哦肉膏蛋白胨培养基的配制肉膏蛋白胨培养基的配制1培养基成分：培养基成分
13、：牛肉膏牛肉膏0.5g，蛋白胨，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂，琼脂 1.52g，水，水100ml。pH 7.52配制方法：配制方法：（1）分分别别称称取取蛋蛋白白胨胨和和NaCl的的所所需需量量，置置于于烧烧杯杯中中，加加入入所所需需水水量量的的2/3左左右右的的蒸蒸馏馏水水。用用玻玻棒棒挑挑取取牛牛肉肉膏膏置置于于另另一一小小烧烧杯杯中中，进进行行称称量量。然然后后加加入入少少量量蒸蒸馏馏水水于于小小烧烧杯杯中中溶溶解解，（也也可可将将小小烧烧杯杯置置于于石石棉棉网网上上适适度度加加热热溶溶解解），倒入上述烧杯中，用玻棒搅拌使药品全部溶解。，倒入上述烧杯中，用玻棒搅拌使药品全部溶解
14、。（2）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）（3）用）用1mol/L NaOH溶液调溶液调pH至至7.5。（4）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌121灭菌灭菌20min。第十五页，讲稿共二十二页哦高氏合成一号培养基的配制高氏合成一号培养基的配制1培养基成分培养基成分可溶性淀粉可溶性淀粉2g，KNO3 0.1g，K2HPO43H2O 0.05g，MgSO47H2O 0.05g，NaCl 0.05g，FeSO47H2O 0.001g，
15、琼脂，琼脂 1.52g，水，水 100ml，pH 7.52配制方法配制方法（1）称量及溶化）称量及溶化 量取所需水量的量取所需水量的2/3左右加入到烧杯中，置于石棉网上加热至左右加入到烧杯中，置于石棉网上加热至沸。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊沸。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，然后倒入上述装沸水的烧杯中，继续加热，使淀粉完全融化。分别称状，然后倒入上述装沸水的烧杯中，继续加热，使淀粉完全融化。分别称量量KNO3、NaCl、K2HPO4和依次逐一加入水中溶解。（培养基使用前每和依次逐一加入水中溶解。（培养基使用前每100ml培养基加
16、入灭菌的培养基加入灭菌的1ml 5MgSO4，1ml 0.1FeSO4溶液。）溶液。）（2）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）加入所需量的琼脂（液体培养基省略此步骤）（3）用）用1mol/L NaOH溶液调溶液调pH至至7.5。（4）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。）将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。（5）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（6）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌121灭菌灭菌20min。第十六页，讲稿共二十二页哦豆芽汁葡萄糖培养基的配制豆芽汁葡萄糖培养基的配制1 1培养基成分培养基成分黄豆芽黄豆芽 10g 10g葡萄糖葡萄糖 5g 5g琼脂琼脂 1.5 1.52g
17、2g水水 100ml 100ml自然自然pHpH2 2配制方法配制方法（1 1）称新鲜黄豆芽）称新鲜黄豆芽10g10g，置于烧杯中，再加入，置于烧杯中，再加入100ml100ml水，小火水，小火煮沸煮沸30min30min，用纱布过滤，补足失水，即制成，用纱布过滤，补足失水，即制成1010豆芽汁。豆芽汁。（2 2）配制时，按每）配制时，按每100ml100ml的的1010豆芽汁加入豆芽汁加入5g5g葡萄糖，煮沸后加葡萄糖，煮沸后加入琼脂（液体培养基省略此步骤）入琼脂（液体培养基省略此步骤），补足失水。，补足失水。（3 3）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（4 4）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭
18、菌110 110 灭菌灭菌20min20min。第十七页，讲稿共二十二页哦马丁培养基的配制马丁培养基的配制1培养基成分培养基成分 葡葡萄萄糖糖 1g，蛋蛋白白胨胨 0.5g，KH2PO43H2O 0.1g，MgSO47H2O 0.05g，0.1孟孟加加拉拉红红溶溶液液 0.33ml，琼琼脂脂 1.52g，水水 100ml，自自然然pH。2去去氧氧胆胆酸酸钠钠溶溶液液 2ml（预预先先灭灭菌菌，临临用用前前加加入入）链链霉霉素素溶溶液液（10,000 u/ml）0.33ml（临用前加入）（临用前加入）2配制方法配制方法（1）称量）称量 称取培养基各成分的所需量。称取培养基各成分的所需量。（2）溶
19、化）溶化 在烧杯中加入约在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基各所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成分。成分。按每按每100ml培养基加入培养基加入0.33ml的的0.1孟加拉红溶液孟加拉红溶液。（3）加入所需琼脂（液体培养基省略此步骤）加入所需琼脂（液体培养基省略此步骤），补足水至所需体积。，补足水至所需体积。（4）分装、加塞、包扎。）分装、加塞、包扎。（5）高压蒸汽灭菌）高压蒸汽灭菌110 灭菌灭菌20min。（6）临用前，加热融化培养基，候冷至）临用前，加热融化培养基，候冷至60左右，按每左右，按每100ml培养基培养基无菌操作加入无菌操作加入2ml的的2去氧胆酸钠溶液及去
20、氧胆酸钠溶液及0.33ml的链霉素溶液（的链霉素溶液（10 000 u/ml），迅速混匀。），迅速混匀。第十八页，讲稿共二十二页哦实验内容实验内容 （棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎）（棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎）1.棉塞的制作。棉塞的制作。2.试管包扎。试管包扎。3.锥形瓶用封口膜包扎。锥形瓶用封口膜包扎。第十九页，讲稿共二十二页哦实验内容实验内容（干热灭菌法）（干热灭菌法）1.将将培培养养皿皿、吸吸管管等等玻玻璃璃器器皿皿洗洗净净干干燥燥后后，用用旧旧报报纸纸包包好好，或或装装入入特特制制的的铁铁筒筒中中(每每个个吸吸管管用用纸纸包包好好后后装装入入铁铁筒筒)。包包装装吸吸管管时时应应将
21、将吸吸取取的的一一端端放放在在取取时时先先拆拆开开的的一一端端，防防止止取取用用时时手手触触及吸取端。及吸取端。2.将将包包装装好好的的玻玻璃璃仪仪器器摆摆入入电电热热烘烘箱箱中中，彼彼此此间间留留有有一一定定的的空空隙隙以以便流通空气。便流通空气。3.关紧箱门，打开电源。关紧箱门，打开电源。4.调节温度调节温度160170，灭菌，灭菌1小时。小时。5.待待自自然然降降温温冷冷却却后后(60以以下下)才才能能开开门门取取出出玻玻璃璃器器皿皿，避避免免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。第二十页，讲稿共二十二页哦实验内容实验内容（高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法）
22、高压蒸汽灭菌法是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。高压蒸汽灭菌法是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。1.关关好好排排水水阀阀门门放放入入去去离离子子水水至至超超过过加加热热管管23cm为为止止，注注意意水水量量一一定定要要加加足足，否否则容易造成事故。则容易造成事故。2.将将要要灭灭菌菌的的培培养养基基、灭灭菌菌水水等等，包包装装好好后后放放入入灭灭菌菌锅锅中中，关关上上器器盖盖，旋旋紧紧螺螺旋旋时时，先先将将每每个个螺螺旋旋旋旋转转到到一一定定程程度度(不不要要太太紧紧)，然然后后再再旋旋紧紧相相对对的的两两个个螺螺旋旋，以以达达到到平平衡衡旋旋紧紧，否则易造成漏气，
23、达不到彻底灭菌的目的。否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。3.通通电电加加温温，同同时时打打开开排排气气阀阀门门，排排尽尽锅锅内内的的空空气气，即即阀阀门门冲冲出出的的全全部部是是蒸蒸气气时时则则表表示示彻彻底底，此时可关闭排气阀门，如果过早关闭阀门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。此时可关闭排气阀门，如果过早关闭阀门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。4.压压力力表表的的指指针针上上升升时时，锅锅内内温温度度也也逐逐渐渐升升高高，当当压压力力表表指指针针升升至至15磅磅（0.1MPa）时时，蒸蒸气气温温度度相相当当于于120121，此此时时开开始始计计算算灭灭菌菌时时间间，控控制制热
24、热源源，使使处处于于15磅磅压压力力保保持持20-30分分钟钟，即即能能达达到到完完全全灭灭菌菌的的目目的的，然然后后停停止止加加温温。对对热热不不稳稳定定的的培培养养基基如如含含有有葡葡萄萄糖糖、氨氨基基酸酸等等物物时时，应应适适当当降降低低压压力力，延延长长时时间间（0.056MPa(112.6)灭菌灭菌30min）。）。5.灭灭菌菌时时间间一一到到，切切断断电电源源，待待压压力力自自然然降降至至零零、锅锅内内蒸蒸气气完完全全排排尽尽时时，打打开开锅锅盖盖取取出出培培养养基基，如如需需制制备备固固体体斜斜面面培培养养基基时时，则则应应趁趁热热将将试试管管斜斜放放在在桌桌上上，冷冷却后便可收
25、起。却后便可收起。6.最后将高压灭菌器内的剩余水排出。最后将高压灭菌器内的剩余水排出。第二十一页，讲稿共二十二页哦实验实验安排安排分为分为4类：类：1-2组制备组制备细菌细菌培养基（培养基（肉膏蛋白胨培养基肉膏蛋白胨培养基）；(8*100ml)3-5组组制备制备放线菌放线菌培养基（培养基（高氏合成高氏合成1号培养基号培养基）；(8*100ml)6-8组组制备葡萄糖氧化酶菌株筛选培养基；制备葡萄糖氧化酶菌株筛选培养基；(8*100ml)制备制备酵母菌酵母菌培养基（培养基（豆芽汁葡萄糖培养基豆芽汁葡萄糖培养基）；做霉菌做霉菌培养基（培养基（马丁培养基马丁培养基）每个类别制备每个类别制备1瓶瓶含含10颗颗玻璃珠玻璃珠的的99ml灭菌水（霉菌为灭菌水（霉菌为95ml）每每2人人准备：带棉塞空准备：带棉塞空试管试管5个个、培养皿培养皿10-12个个、相应的固体培养基、相应的固体培养基100ml另需单独制备另需单独制备4*100ml的灭菌水供全体使用（用于菌液稀释）的灭菌水供全体使用（用于菌液稀释）准备准备1ml 和和200ul 枪头各枪头各4盒供全体使用。盒供全体使用。第二十二页，讲稿共二十二页哦