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1、ll!llr!ll,l,l,l,lfflf rl,ll,lllfllfllll,ll,llllifllY3229808分类号： 耻密级：洳专j单位代码： !虹丛甲睛号，!Q蛆!垒硕士学位论文(同等学力)中文论文题目：基王连墨垒丛堕l焦曼蠢盈盟自闺垄筮瘟扭劐丞堑堑邂控盈窥 一英文论文题目：坠i地也业墼虹hi乜卫鲣g啦幽!2幽1siRna1i1ar。ficiPateinpatho1oIzica1processof坚i泗申请人姓名； 龙 森指导教师： 整 坚 熬攫专业名称： 蕴婆堂研究方向： 挫墅蕴理盔垄所在学院； 垫堂瞳申请人单位： 揎剀壹筮土厶匿匡睦一万方数据基王连旦g壅丛墼兰焦曼塞塾鲍自闺瘗论
2、文作者签名：拳L指导教师签名：论文评阅人1： 隐名迁阅评阅人2： 挂丞蛊 敛拯 逝江太堂评阅人3： 隆熬主 圭堡医痖 揎划立箜厶匿医睦答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：万方数据浙江大学研究生学位论文独创性声明lUl I II I II II II I III I IIIY3229808本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迸婆盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学
3、位论文作者签名： 签字日期： 弘f 7年 厶月7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝婆盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期： 乃17年6月7日导师签名：签字日期：知7年名月7 日万方数据浙江大学硕士学位论文 致谢致 谢作为一名在职研究生，在浙江大学药学院进行同等学力在职研究生的学习令我终身难忘!能够顺利完成毕业论文，并非我个人的功劳，谨向所有关心
4、和帮助过我的老师与同学们致以衷心的感谢!感谢我的指导老师韩峰教授。在大学本科期间我就进行了药理学相关的动物模型研究，在浙江大学第一次上韩老师药理课时，我就坚定了还要继续药理学方面的研究。衷心感谢韩老师在这期间悉心指导和无私帮助!感谢他在课题选题、课题实验设计以及论文的撰写等多个环节中给予指导和帮助。在这几年的学习与相处中，韩老师他个人渊博的学识、严谨的工作态度、求是的工作作风、勇于探索的科学精神让我很受感动；这期间也见证了老师所带领的团队惊人的变化，加深了我对科研思路与临床思维相结合的认识；同时在完成论文过程中，我也体会到科研人员的艰辛，更感受到科研人员收获的乐趣!感谢韩老师带领的优秀科研团队
5、，感谢团队中的廖美华、田允在我论文所涉及到的实验方法、实验操作、论文数据收集整理等方面给予的帮助!感谢黄继云博士和洪玲娟博士在我完成作论文写作过程中给予的帮助!感谢陆楠楠等帮助过我的师弟和师妹们，谢谢你们的陪伴!感谢班主任吴敏老师，感谢研究生办黄佩芳老师，感谢所有任课老师辛苦的付出，感谢我的同学们，是你们，让我拥有这一段难忘的岁月。同时还要感谢我的家人、同事，作为在职攻读研究生，工作与学习间偶有的冲突，感谢你们在我完成学业过程中给予充分的理解和支持!感谢各位论文评阅专家和教授们，谢谢你们在百忙之中抽时间对我的论文进行评阅，并提出宝贵意见!谢谢你们的宽容与理解!最后，再次感谢所有给予我关心和帮助
6、过的人!致谢人龙森2017年1月7日万方数据浙江大学硕士学位论文 中文摘要基于海马CaMKII信号紊乱的自闭症发病机制及药物调控研究浙江大学药学院硕士研究生导 师药理学龙 森韩 峰教授中文摘要自闭症(Autism spectrum disorders)又称孤独症，属严重的神经发育障碍性疾病。自闭症患者大多见于儿童，主要表现为语言形成障碍、社交障碍，此外，另外的症状包括行为刻板与重复，动作僵硬、拒绝改变习惯以及兴趣狭窄等也非常常见。关于自闭症的发病机制与病因，围绕遗传因素、社会心理因素以及神经生物学因素等方面已进行了大量研究，随着对自闭症发病机制研究的深入，医学界已认识到自闭症是一种基于遗传因素
7、作用，受多种环境因子刺激，而导致的弥漫性中枢神经系统发育障碍性疾病。基于遗传因素方面，研究者们开展了从分子遗传到神经免疫，脑功能影像到神经解剖和神经生物学等不同层面的研究。然而迄今为止，仍未能阐明其确切病因和发病机制。近两年在Nature、Science、Cell等刊物连续前瞻性地发表相关综述，建议将自闭症的认知特征与脑神经功能研究结合起来。最近的一些导向性研究均指向一个重要的神经细胞之间特异性通讯结构：突触(Synapse)。在神经生物化学层面，突触蛋白钙离子钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(calciumcalmodulindependent protein kinase，CaMKII)成为研究
8、突触功能所涉及到的重要信号分子的出发点。中枢神经系统CaMKII通过参与突触可塑性调节、基因的转录调节、神经递万方数据浙江大学硕士学位论文 中文摘要质的合成与释放、细胞骨架蛋白磷酸化等发挥多种生理功能。其中，CaMKII激酶活性在海马依存的学习和记忆功能方面的作用也得到公认。根据我们的文献调研，有关神经元CaMKII信号转导网络紊乱与自闭症发病机制的内在关联性未见报道。所以，本研究以突触蛋白CaMKII为切入点，探讨CaMKII磷酸化去磷酸化信号模块在介导自闭症模型海马突触关联调控网络紊乱的分子生物学机制及调控规律。目的：考察自闭症模型海马突触CaMKIIPK刖PKC磷酸化去磷酸化信号模块在自
9、闭症发生病理过程中的变化规律，探索药物调控对自闭症大鼠行为学功能的影响。方法：采用丙戊酸(Valproate，VPA)建立自闭症动物模型，通过Western blotting技术和共聚焦免疫荧光技术考察自闭症模型病理过程中海马caMKIIPKAPKc信号通路相关蛋白激酶磷酸化水平的改变。考察美拉托宁慢性给药后自闭症模型病理过程中海马CaMKII磷酸化水平的变化情况和行为学功能的改善。结果：数据显示，自闭症模型海马突魁CaMKII、Synapsin I、GluRl等CaMKIIPKAPKC通路相关蛋白的磷酸化水平下降，与自闭症模型鼠探索性差，趋避性严重、对新事物的学习和接受的能力下降，具有严重认
10、知障碍的行为表现相一致，证实了海马突触的CaMKIIPKAPKC信号紊乱参与了自闭症的发病过程。自闭症模型组给予美拉托宁后，其降低的CaMKII、Synapsin I、GluRl等蛋白磷酸化水平显著上调，与电生理中LTP的改善及行为学中社交能力的提高相一致，提示美拉托宁慢性给药可以改善自闭症的症状，其机制可能是通过调控CaMKIIPKAPKC磷酸化去磷酸化信号模块相关蛋白的表达。结论：海马突触的CaMKIIPKAPKC信号模块参与了自闭症的发病过程，美拉托宁可以通过上调降低的CaMKII、Synapsin I、GluRl等蛋白磷酸化水平来改善自闭症模型的行为学功能，为自闭症的防治药物的研发提供
11、了新思路和新策略。关键词：自闭症；海马；美拉托宁；钙离子钙调蛋白依赖性蛋白激酶II；蛋白激酶A；蛋白激酶c；学习记忆；磷酸化；长时程增强Ill万方数据Disturbance of hippocampal CaMKII signal participate inpathological process of autismCollege ofPharmaceutical Sciences，Zhejiang University：PharmacologyGraduate student： Sen LongSupervisor：ProfFeng HanABSTRACTAutism spectrum d
12、isorders(ASDs)are a heterogeneous group of bioneurologicaldevelopmental disorders that display common behavioral symptoms，includingpervasive impairments in social interactionsWith the deepening of autism research，ithas been gradually realized that autism is a kind of diffuse central nervous systemdy
13、splasia caused by multiple environmental factorsBased on this understanding，carrying out the research from molecular genetics to neural immune，functional imaging，nerve anatomy and neurochemical etcUp to now,its etiology and pathogenesis havenot been elucidatedSynaptic alterations underlie the abnorm
14、al social and cognitivebehaviors that are observed in humans with ASDsHowever，little is known regardingthe role of hippocampal protein serinethreonine kinases during the pathological processofASDCaMKII is highly enriched in the postsynaptic densities of excitatory synapses andremains constitutively
15、active via autophosphorylation at threonine-286，which facilitatessynaptic efficacyIn addition，PKC isoforms phosphorylate the NMDA receptor,whichis required to enhance CaMKII-dependent longterm potentiation(LTP)Some studieshave suggested an increased prevalence of developmental delays and cognitivedy
16、sfunctions in children who have been exposed to anticonvulsant drugs in uteroMoreover,these studies have indicated that alterations in NMDA tone may beresponsible for the excessive self-grooming observed in an animal model of ASDHowever,the precise intracellular biochemical basis underlying ASDmedia
17、tedcognitive deficits has not been fully elucidatedobj eetive：This study aimed to evaluate the effects of chronic melatonin treatmenton disturbances of the serinethreonine kinases signaling system，synaptic efficacy andTV万方数据浙江大学硕士学位论文 英文摘要autism-like social behavioral disordersMethods：VPA autism rat
18、s were used and different doses of melatonin wereadministrated for four weeksExperimental changes in the phosphorylation of CaMKIIproteins were determined by immunoblotting and immunohistochemistryResults：Compared with the control group，we observed a dramatic decrease inCaMKII(Thr286)phosphorylation
19、 in the hippocampal region of VPAtreated rats atPND50In the present study,a significant decrease in synapsin I(Ser603)and GluRl(Ser83 1)phosphorylation was observed in the hippocampi of VPAtreated rats，suggesting that the dephosphorylation of CaMKIIsynapsin IGluRl in the hippocampusmay be associated
20、 with the pathological processes ofASDTo understand whether the restoration of CaMKIIPKCPKA phosphorylation bymelatonin treatment correlated with changes in memory formation，the hippocampalLTP in the CA 1 region of VPA-treated rats was recordedHeremarkedly reduced LTPwas observed in vehicletreated V
21、PA rats f1 393 4-26of baseline during 15 min；1 1 63 4-24of the baseline during 26-30 min；1 1 32-4-23of the baseline during 56-60 min，n 2 5)Melatonin(5 mgkg)treatment significantly improved LTP inhippocampal CAl regions f1513 4-37ofthe baseline during 15 min；1357 4-36ofthe baseline during 26-30 min；1
22、334 4-39ofthe baseline during 56-60 minn=5)，whereas no significant changes were observed 1-5 min after HFS compared withVPAtreated ratsWe used a social interaction test to investigate whether melatonin improved thedysfunctional social behaviors observed in VPA-treated ratsHere，VPAtreated ratsexhibit
23、ed a significant decrease in social interaction behaviors compared with controlratsIn addition，VPAtreated rats were tested after chronic treatment with melatonin forfour weeks(1 or 5 mgkg，po)using an automated three-chambered social approachapparatusInterestingly,the melatonintreated rats showed a s
24、ignificant rescue of theVPA-induced impairment of social interaction behaviorMoreover,melatonin treatmentincreased the time spent in proximity to and the frequency of reciprocal socialinteractions with a social partner compared with vehicle-infused VPAtreated ratsConclusions：The present results indi
25、cate that disruptions in hippocampalCaMKIIPKAPKC signaling have been observed in VPA ratsImportantly,melatoninN万方数据浙江大学硕士学位论文 英文摘要significantly prevented hypophosphorylation of serinethreonine kinases signaling aswell as decreasing of LTP in the hippocampus observed in ail ASD modelWe suggestedthat
26、restoration of CaMKIIPKCPKA phosphorylation and LTP formation induction bymelatonin might correlate with ameliorated dysfunction of social behavior seen in theVPAtreated ratsKey words：Autism；Hippocampus；CaMKII；PKA；PKC；Learning and memory；Phosphorylation；Longterm potemiationVI万方数据PKAPKCASDPPDGARSCSHQ
27、MELLTPcAMPKinaseIIProtein Kinase AProtein Kinase C英文缩略语Autism spectrum disorderPervasive developmental disordersGilliam Austim Rating ScaleChildrenS Sleep Habits QusetionaireMelatoninLong-term PotentiationCyclic Adenosine Monophosphate，Synapsin I Synapsin IGluRl Glutamate Receptor 1白激酶II蛋白激酶A蛋白激酶C自闭
28、症广泛性发育障碍吉列姆自闭症评定量表儿童睡眠习惯问卷美拉托宁长时程增强环磷酸腺苷神经突触素1谷氨酸受体1NMDAR Nmethyl D-aspartate Receptor N一甲基-D-天冬氨酸受体AMPAR Aamino3hydroxy5methyl一4 a一氨基-3一羟基一5_甲基-4一异isoxazolepropionic Acid Receptor 恶唑丙酸受体MARCKS Myristoylated Alaninerich C Kinase 丝氨酸化的富含丙氨酸的Csubstrate 激酶底物VII万方数据浙江大学硕士学位论文 目次目 次致 谢I中文摘要IIABSTRACT一IV英
29、文缩略语VII目 次VIII弓i 言11实验仪器与材料一411实验动物412实验试剂413实验仪器52实验方法一721实验试剂的配制722自闭症大鼠模型的制备823生长发育和行为学检测824自闭症大鼠脑组织取材925 Westernblot检测相关蛋白表达1026免疫组织化学法检测海马磷酸化CaMKII、Synapsin I等蛋白表达1127数据统计分析一113实验结果1231自闭症动物模型生长发育情况1232自闭症动物模型行为学检测1333自闭症模型海马CaMKIIPKAPKC信号模块相关蛋白表达1434美拉托宁改善自闭症动物模型海马caMKIIPKAPKc信号模块相关蛋白表达1 74讨训2
30、45结论27参考文献28综述33作者简历45攻读硕士期间发表的学术论文46万方数据浙江大学硕士学位论文基于海马CaMKII信号紊乱的自闭症发病机制及药物调控研究浙江大学药学院 药理学硕士研究生 龙森导 师 韩峰教授引 言自闭症(Autism spectrum disorder)又称孤独症，多见于儿童，是一种严重的弥漫性发育障碍性疾病，包括不典型孤独症、Rett氏综合征、Asperger氏综合征以及其他未特定性的广泛性发育障碍等。早在1943年，美国约翰斯霍普金斯大学专家莱奥坎纳首先提出“自闭症”的概念。就临床症状而言，自闭症患者表现为语言形成障碍、社交障碍，但是行为刻板、僵硬、重复性行为以及兴
31、趣范围狭窄等也常见。根据国际和我国卫生组织已有数据，全球自闭症患儿总数达到6700万人左右，平均每1 50个儿童中就有一个自闭症患儿。我国自闭症人数约为千分之六，而且由于诊断手段不足和重视不足，还有许多自闭症儿童没有被发现，由此中国自闭症儿童治疗矫正方面仍面临巨大挑战。自闭症患儿对他人的指令、语言、表情、肢体动作及情绪反应迟钝，甚至无反应，很难通过语言和非语言进行有效的交流与沟通，生活在一个以自我为中心的孤独自闭的空间，大部分患儿生活不能自理，长期都需要他人照管，更谈不上正常入学接受正规的教育，自闭症的高发病率以及患者社会融入能力的低下，给家庭乃至社会都造成很大的经济负担(1o关于自闭症的发病
32、机制与原因，围绕遗传因素、社会心理因素以及神经生物学因素等方面已进行了大量研究，随着对自闭症发病机制研究的深入，医学界已认识到自闭症是一种基于遗传因素作用，受多种环境因子刺激，而导致的弥漫性万方数据浙江大学硕士学位论文 引言中枢神经系统发育障碍性疾病。基于遗传因素方面，研究者们开展了从分子遗传到神经免疫，脑功能影像到神经解剖和神经生物学等不同层面的研究。已有研究结果显示：自闭症患者脑皮层、海马、杏仁体和小脑的体积增大，海马、海马旁回和杏仁体的细胞密度增大，而细胞的体积却缩小【2巧1；神经递质5-TH、GABA、Glu浓度和蛋白CREB、ERK、GluRl、GluR2、GluR3、NRl等蛋白在
33、一些脑区的表达异于常人【昏91。然而迄今为止，其病因和发病机制仍未能准确阐明。近几年国际上已逐渐重视基于认知功能异常的神经环路失调研究，尤其近两年在Nature、Science、Cell等连续前瞻性地发表相关综述，建议将自闭症的认知特征与脑神经功能研究结合起来【m，1。最近的一些导向性研究将均指向一个重要功能结构：突触(Synapse)。在神经生物化学层面，突触蛋白钙离子钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(calciumcalmodulindependent protein kinase，CaMKII)成为研究突触功能所涉及到的重要信号分子的出发点。CaMKII在神经组织中含量相对丰富，是一种多功能的
34、丝苏氨酸蛋白激酶，脑部海马和皮层锥体神经元内高表达。主要集中在神经突触部位，分布于突触后致密物(postsynaptic densitied，PSD)。CaMKII由12个亚基组成，分子量约为600KD，包括Q、D、Y、6等4种类型，其中Gc、p类型仅在神经系统进行功能性表达12-13。CaMKII激酶活性严格依赖于钙钙调素，当加入钙钙调素后其活性增加约200倍【l 41。在钙信号转导通路中，CaMKII一方面接受钙调蛋白Calmodulin(CaM)的活化，另一方面还受PKA、PKC等多种蛋白激酶的调节。在神经系统中，CaMKII通过参与基因的转录调节、神经递质的合成与释放、细胞骨架蛋白磷酸
35、化等发挥多种生理功能，尤其通过突触可塑性调节影响海马学习和记忆功能形成15-18】。迄今为止，有关神经元CaMKII信号转导网络紊乱与自闭症发病机制的内在关联性还鲜有报道，故本研究以突触蛋白CaMKII为切入点，探讨CaMKII信号模块在介导自闭症模型海马突触关联调控网络紊乱的分子生物学机制。褪黑素为一种内源性激素，由松果体的垂体前叶在夜晚分泌产生。在下丘脑视交叉上核(SuprachiasmaticNucleus，SCN)内相对集中，与褪黑素受体结合而发挥作用。对哺乳动物的睡眠昼夜节律调节，并对受外部昼夜循环调节的生物钟万方数据浙江大学硕士学位论文进行校正【19】。褪黑素药物美拉托宁通过内源性
36、激动MTl受体与MT2受体，lll(I-j和接受的能力下降。A BC黼co,7蚶罨罨罨警攀罨薹景善摹摹薹掣=翟箸舄。剁。=OO00OOOOOO00000000O誊ConVPA|I、I，ik碴ht Oark Totaphase phaseContm￥PA ControI VPA图2 自闭症模型行为学观察豹诣钧趵0一建ox口一eo茹哪cl_ooslQ瓣瓣瓣棼2i一一备p舔蚺舯蛰妒罅尊擗静蕺蚺垂释槲蕃瞬万方数据浙江大学硕士学位论文 实验结果33自闭症模型海马caMKIIP脚KC信号模块相关蛋白表达331 CaMKIISynapsinIGluRl相关蛋白在自闭症模型脑海马的表达变化结果显示：与对照组相
37、比，VPA大鼠CaMKII的Thr286磷酸化位点磷酸化水平明显下降。与此相一致，CaMKII的突触前底物SynapsinI(Ser603)、突触后底物GluRl(Ser831)的磷酸化水平均明显下降(图3)。提示自闭症后CaMKIISynapsinIGluRl信号通路磷酸化去磷酸化失衡与自闭症介导的行为功能障碍相关联。Con VPApf-CaMKI：I瓣 闰60kDaThr286 bokuaf )lCaMKII匡：僦p篙高匪7咖a Synapsin匿78胁p-GmluR，1，匪懈胁G慷，匡互懈胁p-actin区43k。a图3 自闭症模型海马脑区CaMKIISynapsinlGluRl通路磷酸
38、化信号变化忆332 PICA通路相关蛋白在自闭症模型脑海马的表达变化结果显示：与对照组相比，VPA大鼠海马脑区PKA磷酸化水平明显下降。突触后膜GluRl存在有两个最重要的磷酸化位点Ser831与Ser845，磷酸化修饰后可影响AMPA受体的功能。我们发现：与PKA磷酸化水平明显下降相一致，其的下游底物GluRl(Ser845)的磷酸化水平均明显下降(图4)，提示自闭症后PKA信号通路相关蛋白磷酸化降低与自闭症介导的功能障碍相关联。阳洲I。洲：v响跚R队5哦州1aI1vMa、Q万方数据浙江大学硕士学位论文 实验结果P，PKA|PKAP为IURliSer845GlURl爹-actinCon VP
39、A42kDa42kDa100kDa106kDa43kDaAMI四重PA lGluRl l毒图4 自闭症模型海马脑区PKA通路磷酸化信号变化333 PKC通路相关蛋白在自闭症模型脑海马的表达变化Gaca2十依赖性蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)能磷酸化的氨基酸残基是丝苏氨酸。PKC可以磷酸化多种蛋白，如糖原合成酶，磷酸化后活性降低。结果显示：与对照组相比，VPA大鼠海马脑区PKC信号通路中phosphoNMDARl(Ser896)，NMDARl和phosphoMARCKS(Serl52)表达有下调趋势(图5)，提示自闭症后PKC信号通路相关蛋白的变化与自闭症介导的功能障碍相
40、关联。M囊l器文融P匪医匦圈匦万方数据浙江大学硕士学位论文 实验结果pNMDARl(Ser896)NMDARlPMARC KS(Serl 52)MARCKS13一actin120kDa115kDa80kDa80kDa43kDa她I-|掌Ga iM-ARC苜KS c。垂图5 自闭症模型海马脑区PKC通路磷酸化信号变化334 激光共聚焦显微镜考察自闭症模型海马脑区锥体神经元CaMKII磷酸化水平变化中枢神经系统中CaMKII通过参与突触可塑性调节、基因的转录调节、神经递质的合成与释放、细胞骨架蛋白磷酸化等发挥多种生理功能。结果显示：PhosphoCaMKII(Thr286)在正常锥体神经元主要表达
41、在胞浆，与13-tubulin存在共定位。与对照组相比(图6)，自闭症造模组的phosphoCaMKII(Thr286)阳性染色明显降低(图6)，提示在自闭症发病过程中CaMKII可能参与了其相关病理变化。16ii兰竺匾匿匡万方数据浙江大学硕士学位论文 实验结果A圄图6自闭症模型海马锥体神经元CaMKII(Thr286)磷酸化水平明显降低(SO，stratum oriens；SP,stratum pyramidale；SR，stratum radiatumScale bar=1 00 pm)34美拉托宁改善自闭症动物模型海马caMIP脚Kc信号模块相关蛋白表达341 美拉托宁对CaMKIISy
42、napsinIGluRl相关蛋白的影响自闭症模型组给予美拉托宁4周后，考察VPA大鼠海马脑区CaMKIISynapsinIGluRl信号模块蛋白质磷酸化水平变化规律。结果显示：美拉托宁慢性治疗组的CaMKII蛋白磷酸化水平较模型组显著上调，提示美拉托宁对于自闭症模型CaMKII蛋白磷酸化水平降低具有逆转调控作用。我们也发现美拉托宁高剂量(5 mgkg)给药组较美拉托宁(1 mg&g)组对phosphoGluRl(ser831)有更强的调控作用。但是，phospho-CaMKII和phosphoSynapsinI的变化在美拉托宁(1 mgkg)和美拉托宁(5 mgkg)给药组之间未见显著差异(图
43、7)。万方数据浙江大学硕士学位论文 实验结果APCaMKII(Thr286)CaMKp-actin120100舌 8020 60器4020OC60kDa50kDa60kDa50kDaB p-Synapsinl(Ser603)Synapsin120100舌 802 60O零4020O|芦，枣M匡至78巨量78 kDakDap，枣心，P-GluRl(set831)GIuRl120100舌 80U芎60零40200C0n VPA MELl MEL106kDa擎6kDa矿一图7美拉托宁对CaMKIISynapsinIGluRl相关蛋白的影响习i一三三三磊一 蓦一盛一_忖u碳蝴卅幽蕾一心a皿础鹕。匹盘盔
44、悄_直H一业墨瞎。a皿测埘a衄皿一吣雌叫御般一E一料础惜墨黼黼。褂四岱撕。澉丑万方数据浙江大学硕士学位论文 实验结果342激光共聚焦显微镜确认了美拉托宁对CaMKII磷酸化水平降低的逆转作用结果显示：PhosphoCaMKII(Thr286)在正常锥体神经元主要表达在胞浆(绿色)，与13-tubulin(红色)存在共定位。 与对照组相比(图8)，VPA大鼠组的PhosphoCaMKII(Thr286)阳性染色荧光强度明显降低，而慢性美拉托宁药物治疗对这种降低有一定改善作用(图8)，与前面Western Blot结果相一致。PhosphoCaMKI Merged Magnification图8美
45、拉托慢性给药减轻自闭症大鼠海马CaMKII去磷酸化水平343 美拉托宁对PKA通路相关蛋白的影响自闭症模型组给药美拉托宁后，我们发现美拉托宁高剂量(5 mgkg)给药组较美拉托宁(1 mgkg)组对phosphoPKA有更强的调控作用。此外， GluRl(Ser845)磷酸化水平较模型组显著上调，提示美拉托宁对于自闭症模型PKA和GluRl磷酸化水平降低具有逆转调控作用。 但是，GluRl(Ser845)磷酸化水平在美拉托宁(1 mg&g)和美拉托宁(5 mgkg)给药组之间未见显著差异(图9)。万方数据浙江大学硕士学位论文 实验结果APPKA(Thrl 97)訇PGluRl(Ser845)100kDaPKA巨三三三三三勇42k。aGluRl I三三至垂三三塑1。6k。aCon VPA MELl MEL5 Con VPA MELl MEL5一 一图9美拉托宁对PKA通路相关蛋白的影响344美拉托宁对PKC通路相关蛋白的影响自闭症模型组给药美拉托宁后，其模型组海马PKC途径中p-NMDARl(Ser896)，NMDARl和p-MARCKS(Serl52)