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1、学习必备欢迎下载第二章基因的结构和功能一基因一酶学说：该学说具体体现了基因和酶之间的关系，表明每个基因控制单个酶的合成或激活其活性。转化：通过裸露的外源DNA 传递遗传信息。转染：是转化的一种特殊形式。用于原核细胞时，其外源 DNA 特指离体的phage DNA 来感染感受态的细菌，并在其中表达；用于真核细胞时对任何裸露DNA 的吸收都成为转染。接合：通过细胞与细胞之间的直接接触。遗传信息单向传递到受体的过程。转导：一个细胞的DNA 或 RNA 通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。自主发育：不受周围细胞的影响，按照自身基因型发育的现象。非自主发育：受周围细胞的影响，不按自身基因型发育的现象。
2、1902 英 Garrod.A 首先研究了四种遗传病:黑酸尿病白化病胱氨酸尿病戊糖尿病； 1952 年发现糖原贮积症（ Von Gierke 氏病）病人缺乏葡萄糖-6-磷酸酶芽盘移植实验第二节人类酶缺陷的遗传基础一、半乳糖血症二、白化病三、苯丙酮尿症四. 莱-尼二氏症第三节遗传咨询和产前诊断一、遗传咨询（Genetic counseling ） ：询问先征者的完整病史，家族史；查阅McKusick,V.A:MendlianInheritance in Man 是否为遗传病，遗传类型，发病风险？通过产前诊断，决定是否终止妊娠。二、产前诊断（prenatal diagnosis） ：指征是：（1）
3、亲体为携带者； （2）母亲曾生育过先天性异常的婴儿； （4）35-40 岁以上的高龄孕妇； （5）曾有多次流产，早产和死胎的孕妇；（6）亲体曾多次接触过放射线或在妊娠早期服过一些胎儿致畸药物。采集标本的方法：羊膜穿刺抽取羊水，收集胎儿脱落细胞 ;从宫颈粘液中获取绒毛膜细胞;直接从子宫控中吸取绒毛膜细胞;超声波可用于产前诊断神经管缺陷，如无脑儿，脊椎裂和水脑儿。胎儿镜（fetoscope）又称羊膜镜或宫腔镜。产前诊断的方法：细胞学，生物化学，分子生物学三、携带者的检出：方法：(1) 染色体核型分析(2) 酶活性的检测(3) 分子生物的方法。实例：神经节苷酯贮积病GM2-I 型Tay-Sachs
4、症，家族性黑蒙性痴呆，氨基已糖苷酶A）缺乏症四、分子病（ molecular diease） ：分子病是指由于基因的突变引起了蛋白质分子结构的改变而导致的疾病，如镰形细胞贫血（sickle cell anenia ） 。第四节基因的精细结构和顺反测验(应为百度文库的原因，此处删除了) 当顺式有功能，而反式没有功能时，突变位点在同一顺反子内；当顺式有功能，而反式也有功能时，突变位点在不同顺反子内。第三章遗传物质的分子结构和性质第一节核酸是遗传物质遗传物质必须具备哪些特点？：在体细胞中含量稳定；在生殖细胞中含量减半；能携带遗传信息；能精确地自我复制；能发生变异；（DNA RNA是遗传物质的证明）
5、一、遗传物质的发现： 1928 年 Frederick Griffith 转化实验； 1944年，Avery 在离体条件下完成转化。1952 年，Hershey 和 Chase 噬菌体感染实验二、RNA 也是遗传物质： 1956 年 A.Gierer 和 G.Schraman发现烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV ） ，其遗传物质是RNA 。 1957 年美国的Heinz Fraenkel-Conrat 和 B.Singre 用重建实验证实了这一结论。第二节DNA 和 RNA 的化学组成及双螺旋模型一、DNA 和 RNA 的化学组成二、 DNA 双螺旋模型的诞生：
6、Watson & Crick 建立双螺旋模型主要是受到4 个方面的影响：（1） 1938年 W.T.Astbury & Bell用 x 衍射技术研究DNA 。 1947 年拍摄了第一张DNA 的衍射照片， 并推断 DNA精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 1 页，共 16 页 - - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载分子的结构是： 柱状；多核苷酸是一叠扁平的核苷酸；核酸残基取向和分子长轴垂直,间距为 3.4。 （2）1951 年 Pauling 和 Corey 运用化学的定律来
7、推理，而不做具体的实验，建立了蛋白质的 -螺旋模型；（3）晶体学者 美J. Donoh & Chargaff的指点。（4） R.Franklin & Wilkins在 1952年底拍得了DNA 结晶 X 衍射照片。三 、双螺旋模型(double helix model) 双螺旋模型有以下特点：(1) DNA 分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。 (2) 双螺旋的直径为2nm；螺距为 3.4nm，上下相邻碱基的垂直距离为0.34nm，交角为 36。 (3) 两条链反向平行，即两条链的方向相反；(4) 糖一磷酸键是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直。(5) 糖与附着在糖上的碱基近于垂
8、直。(6) 碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶。(7) DNA 双螺旋有大沟（ major or wide groove ）和小沟（ minor or narrow groove ）的存在。第三节DNA 的结构和性质一、DNA 二级结构的稳定因素(1)碱基对之间的氢键。(2)碱基的堆集力。它包括：疏水作用；范德华力；磷酸基的负电荷斥力模型中的碱基配对有何重要性？A-T,G-C 配对可形成很好的线性氢键；A-T 对和 G-C 对的几何形状一样，使双链距离相近，使双螺旋保持均一；碱基对处在同一平面内。不论核苷酸的顺序如何，都不影响双螺旋的结构；为 DNA 半保留复制奠定了基础。二、 双螺旋结
9、构的构象变异DNA 的构象现已知有A，B，C，D，E，T，Z 7 种。生理条件下：B 三种主要构象：B引起 DNA 双链构象改变有以下因素： （1）核苷酸顺序；（2）碱基组成；（3）盐的种类；（4）相对湿度。立体异构：分子中原子互相连接的方式和次序相同（构造相同）,但在空间的排列方式不同而出现的异构现象。平面偏振光和旋光性光是一种电磁波，它的电场或磁场振动的方向与光前进的方向垂直。在普通光线里，光波可以在垂直于前进方向平面上的任何方向振动。(一)左旋 DNA Z-DNA 的结构特点 （1）糖磷骨架呈 “ 之” 字形（Zigzag）走向。 （2）左旋。(3) G 的糖苷键呈顺式(Syn) ，使
10、G 残基位于分子表面。 （4）分子外形呈波形。(5) 大沟消失，小沟窄而深。(6) 每个螺旋有12bp。ZDNA 存在的条件 (1) 高盐： NaCl2Mol/L, MgCl20.7 Mol/L(2) Pu,Py相间排列：（3）在活细胞中如果 m5C,则无需嘌呤 -嘧啶相间排列， 在生理盐水的浓度下可产生Z 型。(4) 在体内多胺化合物，如精胺和亚胺及亚精胺和阳离子一样，可和磷酸基因结合，使B-DNA 转变成Z-DNA 。(5)某些蛋白质如 Z-DNA 结合蛋白带有正电荷，可使 DNA 周围形成局部的高盐浓度和微环境。(6)负超螺旋的存在生物学意义： (1) 可能提供某些调节蛋白的识别。啮齿类
11、动物病毒的复制起始部位有d（GC）有交替顺序的存在；(2)在 SV40 的增强子中有三段8bp 的 Z-DNA存在。 (3)原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核有转录活性，小核和繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA 结合，而不和小核的DNA 结合，说明大核DNA 有 Z-DNA 的存在，可能和转录有关。(二)右旋 DNA ：目前已知DNA 双螺旋结构可分为A、B、C、D 及 Z 型等数种，除Z 型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋。三、DNA 的三级结构所谓 DNA 的三级结构， 是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上， 是指双螺旋基础上的卷曲三 级 结
12、构 包括 链的 扭结和 超 螺旋 或者 是单 链形成的 环或 是环状DNA中 的 连环 体超 螺旋 ：（Supercoied） 松驰型 DNA （relax form ） 。超螺旋（ Supercoied） DNA ，负超螺旋正超螺旋检测 DNA 三级结构的方法：密度梯度离心凝胶电泳电镜观察精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 2 页，共 16 页 - - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载原核生物 DNA 的三级结构：绝大多数原核生物的DNA 都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一
13、步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。超螺旋的定量描叙：White 方程：L=T+W L（Linking nnmber ） ：链环数或称拓扑环绕数，指cccDNA 中一条链绕另一条链的总次数。其特点是(1) L 是整数； (2) 在 cccDNA 中任何拓扑学状态中其值保持不变；(3)右手螺旋对L 取正值。W（Writhing number） ：扭曲数，即超数旋数。其特点是：(1)可以是非整数；(2)是变量； (3)右手螺旋时， W 取负值。T（Twisting number ） ：缠绕数，即双螺旋的圈数。其特点是：(1) 可以是非整数；(2) 是变量； (3) 右手螺旋时 T 为正值。超螺旋的
14、量度可以用超螺旋密度来表示： =（L-T ）/T 在天然 DNA 中，约为 -0.05 第四节DNA 的变性与复性变性或解链：对双链进行缓慢地加温，使氢键断裂，双链解开，产生单链的分子的过程成核作用： 复性过程中互补的两条链首先是中心部分互补碱基对之间形成氢键，接着像拉拉链一样，其余部分随之形成双链。又称为拉拉链作用。复性或退火：核酸分子在变性后分开的互补链缓慢冷却，重新形成互补双链的过程。DNA 的复性对片段有两个要求：(1) 互补顺序的碰撞和排列；(2) 碱基的正确配对和氢键的形成。一、DNA 变性物理性质发生变化： （1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；（2）提高了对紫
15、外线的吸收能力， 此称为增色效应 （hyperchromic effect ） 。双链 DNA 的 A260=1.00（浓度为50g/ml时，对波长 260nm 紫外线的吸收能力） ；单链 DNA 的 A260=1.37 ；游离碱基或核苷酸的A260=1.60 。解链温度（ melting temperature, Tm ）或熔点， Tm 是 A260 的升高达到极大值一半时的温度。即是变性温度范围的中点。影响变性的因素：高温、酸、碱、尿素、甲酰胺影响值的因素：外部条件 :如温度和正离子的浓度:浓度低于0.4mol/L ，单价阳离子增高10 倍,Tm增加16.6内部条件：GC 含量及分子类型当
16、GC 的含量上升1%，则Tm 上升0.4马默多蒂（Marmur-Doty ）关系式： Tm = 69.3+0.41(G +C)% ，或 GC%=（Tm-69.3 ） 2.44 二、DNA 复性复性动力学公式根据复性动力学公式我们可以知到些什么？(1) 单链浓度随着时间的增大而减小；(2）反应速率取决于初始的单链浓度Co；(3) 以反应浓度和COt1/2 为座标可绘复性曲线；(4) 通过 C0t1/2 值可测原核生物基因组的大小；已知大肠杆菌的基因组为4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec COt1/2 （大肠杆菌基因组 DNA ）/9M.sec = 任何基因组大小/4.2X106
17、bp(5) 原核生物基因组大小不同，复性曲线不同；(6) 可用以区分真核生物和原核生物基因组。单一顺序和重复顺序复性动力学曲线的区别真核生物DNA有重复顺序， 原核物多为单一顺序。(1) 单一顺序的复性曲线常只有一个拐点，而重复顺序常有多个拐点。(2) COt 比值变化范围不同：原核生物的COt 比值小于100,真核生物的COt 比值大于100。影响复性反应的因素(1) DNA 片段的大小； (2) DNA 的浓度； (3) DNA 复杂性 ;(4) 温度。最佳复性温度一般比 Tm 低 25 C。(5) 盐的浓度：复性时要求盐的浓度达到足够高，为什么？复性反应中如何知道单链已结合成双链？可以通
18、过哪些法来检测？(1) 减色效应：测定光密度，即OD 值， DNA 从单链变成双链，OD260 减少 30%(2) 羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石对双链DNA 吸附较牢，不易吸附单链。（）羟基磷灰石柱层析第五节核酸分子杂交技术分子杂交：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。杂交的共同特点(1)都是应用复性动力学原理；(2)都必须有探针（ probe）的存在。探针就是用同位素精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 3 页，共 16 页 - - - - - - - - -
19、- 学习必备欢迎下载或非同位素如荧光染料，生物素等标记的短片段特异DNA 或 RNA 顺序。一、核酸分子杂交的基本原理DNA 变性方法热变性： 90-100 酸碱变性：常采用碱变性化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm) DNA 复性或杂交 (hybridization)DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等影响杂交的因素：核酸分子的浓度和长度浓度大，复性快；分子量大，复性慢温度 离子强度杂交液中的甲酰胺核酸分子的复杂性非特异性杂交反应预杂交：鲑鱼精子DNA 封闭非特异性杂交位点分子杂交的基本方法
20、：Southern 印迹法Northern 印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western 印迹法液相杂交Southern 杂交： DNA/DNA杂交，即将DNA 电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Southern 杂交的主要步骤：待测DNA 样品的制备、酶切待测 DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中 DNA 的变性： 碱变性Southern 转膜： 硝酸纤维素 (NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备Southern 杂交杂交结果的检测：基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳检测酶切后 DNA 片段琼脂糖凝胶电泳检测Northern 印迹杂交：检测RNA （
21、主要是 mRNA ）的方法与 Southern 杂交的不同：靶核酸：RNA 。RNA 电泳。转膜：不需变性斑点印迹杂交：将RNA 或 DNA 变性后直接点样于NC 膜或尼龙膜上。优点：简单、快速、可同时检测多个样品原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究。不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高。准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。核酸原位杂交的基本步骤：玻片原位杂交：细胞或组织的固定载玻片；组织细胞杂交前的预处理；去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白；膜上分子杂交；探针的选择和标记；杂交结果检测。探针的标记探针的种类
22、： cDNA 探针、基因组DNA 探针、寡核苷酸探针、RNA 探针。标记物：核素标记物（同位素标记） ：32P、35S、3H 等；非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等Western 杂交印迹法 (Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。主要步骤：蛋白质样品的制备；SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE) 电泳；蛋白质的电转移：NC 膜；靶蛋白的免疫学检测：靶蛋白于第一抗体（一抗）反应；与标记的第二抗体（酶标二抗）反应；显色反应：酶促反应第四章基因组和染色体基因组：是指一个单倍体的染色体数目
23、（遗传物质的总量）。原核基因组含有大量单一顺序，仅有少量的重复顺序。真核基因组含少量单一顺序和大量重复顺序。原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA 。第一节原核生物基因组的结构特点一、类核的结构E.coli 2.4109 Da，42000 Kb（1300 微米） ，闭合环状，约编码2000 个基因。类核（nucleoid ） ：原核生物的DNA 位于细胞中央支架(scafford） ：100个 DNA 环组成，每个环长40Kb，13 微米。每 200bp 就有一个负超螺旋（=-0.05）,即基因组中含5%的负超螺旋。超螺旋以两种
24、状态存在： （1）自由状态的超螺旋，可在环内传递张力。（2）蛋白结合超螺旋受到束缚，不能传递张力。二、重叠基因 (overlapping gene) 三、质粒 (plasmid) 特点 :双链环状DNA 分子；带有一些特殊基因(抗生素抗性基因)；具有复制起始区；可经整合到宿主的染色体中，和细菌染色体同步复制；精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 4 页，共 16 页 - - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载质粒类型1.抗性质粒：带有抗性基因，可使宿主细菌对某些抗生素产生抗性2.致
25、育因子：可以通过接合在供体和受体之间传递遗传物质，其基因组具有转移区，重组区和复制区3.Col 质粒 :含编码大肠杆菌素基因。4.降解质粒 :这种质粒编码一种特殊蛋白，可使宿主菌代谢特殊的分子，如甲苯或水杨酸。 5.侵入性质粒。如根癌农杆菌中的Ti 质粒。第二节真核基因组的复杂性分子量约为31012 道尔顿长度为 2106Kb，形态为线状，约编码100 万个以上的基因。人类细胞在二倍体的核中DNA 长约 30 亿个碱基对估计编码3 万个基因，每条染色体含碱基8 千万至3亿不等。现已有5 千个基因被编目，1900 个基因已进行了染色体定位，600 个已被克隆分离出来。若将一个细胞中每条染色体的D
26、NA 首尾彼此相接，全长约200cm。染色质 (chromatin): 从细胞中获取的DNA 和蛋白质的复合物常染色质异染色质在染色质中和结合的有两类蛋白：组蛋白非组蛋白三、染色体的高级结构10nm 的核丝； 30nm 螺旋管；放射环模型；螺旋环模；放射、螺旋环共存模型；袢环模型；螺旋折叠 U.K.1988) 等模型；侧环模型第三节着丝粒和端粒一. 着丝粒：由三个功能区组成；中部的元件(II) 由 8090bp 组成， A+T 含量高， 90%；左侧的元件(I)含有 PuTCACPuTG 顺序（ Pu 是嘌呤）；右侧的元件 (III) 是由 26bp 组成的保守区，此区也是A-T丰富区；所有真
27、核生物的着丝粒功能都相同，但其DNA 却具有种的特异性。二：端粒：共同特点：每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序。Cn(A/T)m ，其中n1，而m=14。在端粒区域中有一种特殊的不连续排列，产生单链断裂的形式，这种结构并不能被连接酶将缺口封闭起来，而在正常情况下连接酶是可以作用DNA 链上的缺刻（nick） 。提纯的天然的端粒区可直接用E.Coli DNA多聚酶I 进行缺口平移(nick translation) 。在端粒区的最末端可能带有3 -OH 的单链末端回折成了发夹(hairpin) 结构。端粒的双链部分中含有T2G4 的顺序在3末端，排列方向是朝向染色体的中心部位。细胞中，端粒
28、是和一些非组蛋白相结合，形成复合体，常表现为异染色质或构成染色体的末端结节。端粒的功能：保持染色体的稳定；使线形DNA 顺利复制；影响染色体的行为；可能控制细胞的寿命；和核骨架的组成有关第四节染色体的核型和分带1 核型(Karyotype) ：在一个细胞中全套的中期染色体称为核型2 染色体带型G 带： iemsa 染色 ；最常用先用加热或蛋白水解酶进行预处理，然后用染料染色，结果呈现清晰特异的带。反映了染色体上的丰富区。用电镜扫描可在带区见到收缩的痕迹，但不可长期保存。C 带；Q 带：芥子奎吖因（guinacrine mustard）染色；直接将未染色的中期染色体染色，在与带相同的区域产生另外
29、的荧光带在荧光显微镜下清晰可见。其H32-H42 八聚体2H2A-H2B 核心颗粒染色质小体 (166bp)146bp核小体DNA 166bp (200bp) H1 20bp DNA 连接区(常为 3234bp)核小体的组成精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 5 页，共 16 页 - - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载？感性较强。T 带；N 带； R 带:Reverse；是和带相反的带，即带的深染区正是带的浅染区。反之亦然。用常规颜料染色。第五节单一顺序和重复顺序一、单一顺序
30、(Unique sequence )在基因组中有一个或几个拷贝。不编码真核基因(4070%)原核基因(大多 )编码二、短片段重复顺序（1）正向重复又叫顺向重复； （2）反向重复；（3）回文顺序：是一种旋转对称。特点是正读反读意思都一样。存在于各种蛋白质的结合位点。三、长片段重复顺序轻度重复顺序 : 在基因组中含有2-10 拷贝 ，酵母 tRNA 基因、人和小鼠的珠蛋白基因等。中度重复顺序: 长约 300bp 基因组中约有10-几千个拷贝的顺序。如rRNA 和 tRNA 基因。 tRNA 基因一般都分布于基因组中，而rRNA 常集中分布于核仁形成区。基因家族（gene family） ：在真核生
31、物基因组中，来源相同、结构相似、功能相关的基因。基因簇（gene family） ：相同或相关的基因排列在一起。分散的基因家族其成员不在同一基因簇（gene cluster）内，串联基因家族的成员都集中串联在一起。有的基因家族成员不仅结构和功能不同，表达的时间也不同。孤散子（ orphons） ：由串联重复顺序中派生出的单个基因，远离其家族，表达会发生改变。假基因：基因家族中因突变而失去功能的基因不能产生具有生物活性的蛋白质。加工假基因（processed pseudogenes ） 。有以下的特点：缺少正常的内含子；3 末端有多聚腺苷酸；5 端的结构和 mRNA 的 5 端十分相似；两侧有顺
32、向重复顺序的存在。对以上特点作何推论？因此人们推测它似乎和mRNA 一样经过了转录后加工，因此也称其为加工假基因；四 、Alu 家族：长约 300bp；Alu 顺序也称为短的分散因子；由RNA 多聚酶 III 转录的。在基因组中 30 万个拷贝；在 170bp 处有一 AluI 的酶切位点；由两个 130bp 的串联重复顺序组成；在二聚体的右半部有31bp 插入序列，此插入顺序来自7SL RNA 。 Alu 顺序有何应用价值？短的分散因子 (short interspersed elements, SINEs):由 RNA 多聚酶转录的. 长的分散因子 (long interspersed e
33、lements, LINEs): 在哺乳动物中,由 RNA 多聚酶转录的. L1 家族：长 6500bp 左右 称为长的分散因子；在基因组中约6 万个拷贝； 由 RNA 多聚酶 II 转录的。属于一种转座因子五高度重复顺序：卫星 DNA (satellite DNA)：卫星 DNA(satellite DNA)是一类高度重复序列DNA在介质氯化铯中作密度梯度离心，离心速度可以高达每分钟几万转；此时 DNA 分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中，小的分子处于上层，大的分子处于下层；从离心管外看，不同层面的 DNA 形成了不同的条带。根据荧光强度的分析，可以看到在一条主带以外还有一个
34、或多个小的卫星带。 这些在卫星带中的DNA 即被称为卫星DNA ，这种 DNA 的 GC 含量一般少于主带中的DNA ， 浮力密度也低。隐蔽卫星 DNA(cryptic satellite) 自私DNA（selfish DNA ） 伊甸园DNA (Garden of Eden DNA ；小卫星(minisatellite ) 重复序列可变数DNA 指纹（ DNA fingerprints ）第六节C值矛盾C 值矛盾 (C-value paradox) ：值和生物结构或组成的复杂性不一致的的现象。可能产生的原因是什麽？断裂基因间隔顺序(spacer):基因间不编码的部分(有转录间隔区和不转录间隔
35、区) 间插顺序 (intervening sequence) :基因内部不编码的区域,即内含子 (intron) 可编码的内含子:成熟酶 ,内切酶一、内含子的发现二、内含子的结构特点(一) 内含子和外显子的分布(二) 内含子的相对性三、内含子的生物学意义：有利于储存较多的遗传信息；有的内含子可编码内切酶。成熟酶归巢调控提高进化速率精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 6 页，共 16 页 - - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载第五章DNA 的复制第一节半保留复制的验证半 保 留
36、 模 型 （ semioconservetive model ） 全 保 留 复 制 模 型 (conservetive model) 分 散 模 型(Dispersive model) 。验证半保留复制的实验一、Meselson-Stahl 实验二、 Taylar 实验三、姐妹染色单体差别染色方法（sister- chromatid differential staining ）5 溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine ，简称 BUdR）斑色染色体（ Harlequin chromosome ）四、Cairns 复制模型 型复制第二节参与 DNA 复制的酶和蛋白一、快停突变
37、与慢停突变快停突变：把细菌培养温度提高（42 45）复制迅速停止。快停突变所涉及的产物和链的延伸有关慢停突变：将细菌培养温度提高，DNA 合成并不立即停下来，延续一段时间后合成才会停止。慢停突变表明突变的基因和复制起始有关。筛选出与 DNA 合成、延伸有关的蛋白和酶。二、原核生物复制的酶系统（一） DNA 聚合酶1.DNA 聚合酶的共同特点（1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA 链，必须要有引物提供3OH； （ 3）合成的方向都是5 3 （4）除聚合 DNA 外还有其它功能。复制的特异性 （复制的忠实性） ：(1)合成前错误控制：能够通过匹配的化学特点加以识别，检查进入的碱基是否和
38、模板互补，这是一种合成前的预防措施。(2)校正控制：在新的碱基加到链上以后，来检查碱基是否配对。发生错配时，会把刚加上去的错误碱基切除。2.DNA 聚合酶的结构和功能DNA 聚合酶有 6 个结合位点： (1) 模板结合位点； (2) 引物结合位点；(3) 引物 3 OH 结合位点；(4) 底物 dNTP 结合位点； (5) 5 3外切酶结合位点；(6) 35校正位点。（二） DNA 聚合酶的功能特点：主要用于DNA 的修复和后随链中RNA 引物的置换。使用的模板范围较宽（ 1）有引物的ssDNA（线状或环状） 。 （2）有缺口的dsDNA （无论大小） ； （ 3）有切口（nick）的双链DN
39、A 。1. 5 3聚合功能2. 3 5外切活性3. 5 3外切活性 (1)切口平移（ nick translation ） ；(2)链的置换； (3)模板转换（ template-switching ） 4. 内切酶活性（三） DNA 多聚酶的结构全酶在 DNA 上的装配分为三个阶段： （ 1）一个二聚体加上一个复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA 在于 ,复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与 DNA 结合。（3）二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。（四）DNA 连接酶其作用机制是分三步进行：1、EATPEAMP ppi 在 E.coli 中，ENA
40、D EAMP NMN（烟酰胺单核苷酸）2、E-AMP 上的 AMP 转移到 DNA 的 5 -PO4 上使其活化3、活化的5 PO4与相邻的 3 OH 作用形成 3 5 磷酸二酯键，并释放出AMP 。单链结合蛋白又称为双螺旋去稳定蛋白；由177 个 aa 组成；在E.coli 中以四聚存在；分子量为74KDa ，每个分子可以覆盖32nt；在原核中SSB 与 DNA 结合表现出协同效应。 （1）SSB 之间的相互作用；（2）第一个 SSB和 DNA 的结合改变了DNA 的结构。（六）解旋酶 (helicase) 第三节复制的起点、方向和终点一. 研究方法：1. 用同位素标记电镜观察及变性法2.
41、用噬菌体插入标记法同步培养不同步培养3. 变性定性法（ denaturation mapping）4. 双向电泳法精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 7 页，共 16 页 - - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载不同生物复制起点和方向：E.coli 定点、双向对称复制。T7 在近一端的17处开始，向两端延伸。枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。质粒R6K 早期为单向复制，复制了约1/5 时基因组进行双向复制。质粒 Col E1 有固定起始点，但却为单向复制。mt DNA 进
42、行 D（displaced loop）环复制 。真核有多个复制起点（i） ，双向等速复制。（一）环状DNA 复制复制起始区的结构特点是：（1）富含 AT，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构 （914 个 GATC）8 个 GATC 较保守 ,CATC 中的 “ A”已甲基化 ;（3）具有4 个反向重复顺序，作为蛋白结合位点； （4）此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：转录产生引物；产生复制必要的蛋白；产生调节功能的RNA ；起转录激活作用。哪些 DNA 进行滚环复制 ?真核 rDNA 的扩增 ,F因子 DNA 的转移 ,裂解途经的复制, X174,M13.G
43、4等单链环状DNA 噬 菌体第二阶段复制都是进行滚环复制的 . （二）线状DNA 复制DNA 中间起始复制DNA 末端起始复制线性双链DNA的复制有的是从一端开始的:腺病毒（Adenovirus ） 29 DNAs 脊髓灰质病毒（poliovirus) ；腺病毒 DNA 全长 35937 bp,线性双链，两端各有反向重复顺序103162 bp，两末端各有 50 bp 为复制起点。其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。（三）复制的终止1.E.coli 的复制终止 (环状 DNA 复制终止 )现已发现有两个终止区域（terE,D,A 和
44、 ter C,B） ，位于相遇点的另一侧100Kb 处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。ter 顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要tus基因的产物Tus，Tus 能识别 ter 保守顺序，并阻止复制叉继续前进。ter-Tus 复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止2.线性 DNA 的复制终止两个5有空缺的分子通过3端凸出的重复序列互补配对。DNA 多聚酶从 3端延伸填补起这个空缺，留下最后的裂隙由连接酶封闭，产生了一个大分子串联体。由限制酶在连接处交错切割，产生 3 凹端， 由 DNA 多聚酶在3 -OH 上延伸填满新的空缺，产生
45、两条完整的双链。第四节复制的过程一、半不连续复制1、冈崎片段： 任何一种 DNA 聚合酶合成方向都是从5向 3方向延伸， 而 DNA 模板链是反向平行的双链，这样在一条链上，DNA合成方向和复制移动方向相同（前导链），而在另一条模板上却是相反的（后滞链） 。那么在复制叉中新链是如何合成的呢？Reiji Okazaki 在 DNA 合成实验中添加放射性的脱氧核苷酸前体观察到前导链连续合成，滞后链分段合成。 这些分段合成的新生DNA 片段称冈崎片段。细菌冈崎片段长度1000-2000 核苷酸，真核生物冈崎片段长度100-200 核苷酸。（1）脉冲标记实验：以E.coli 为材料，在培养时，培养基中
46、加入同位素3H 标记的 dTTP，经 30 秒后，DNA刚开始复制，分离DNA ，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl 密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H 标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S 左右，即都是长10002000Nt 的 DNA 片段，而亲本链要比它大 2050 倍。（2）脉冲追逐实验：早期合成的DNA 片段以后的命运又是如何的？是依然如旧的短片段，还是连接成了长片段。这个实验是先进行标记培养30 秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA 不再是短片段
47、，而和总DNA 的情况相似，沉淀系数为 70S120S 较长的片段， 这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment ） 。精品资料 - - - 欢迎下载 - - - - - - - - - - - 欢迎下载 名师归纳 - - - - - - - - - -第 8 页，共 16 页 - - - - - - - - - - 学习必备欢迎下载形成前导链小片段的原因：细胞内都存在有dTTP 和 dUTP，而 DNApol 却并不能区分它们，因此也会将 dUTP 加入到 DNA 中，形成AU 对。那么在DNA 中为什么没有
48、U 的存在呢？这是因为E.coli 细胞里有双重“保险” ，防止了U 的“混入”。第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成 dUMP ，dUMP 是不能作为DNA 合成的底物，这样它就不再能加入DNA 中。第二道关是尿嘧啶 N-糖苷酶（ uracil N-glycosylase ） ，它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu 和 Py 位点（ apurinic or apyrimidinic ，AP） ，再由 AP 内切酶在 AP 位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶 N-糖苷酶作用较快，而AP 酶作用较慢， 在新链合成之初约1200bp 就有可能掺进一个U，但很快就
49、被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP 酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH 沉淀时， AP 位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。复制体和回环模型：双螺旋复制是同时复制的：每一个复制叉含有特别大的多聚体复合体，它是一个不对称的二聚体，可能同时催化两条链。在电镜下观察到双螺旋DNA 聚合酶 也同样具有两个活性部位；复制体（ replisome） ：是由解旋酶、引发酶和DNA Pol 全酶组成的复合体。回环模型：DNA 合成时，沿着复制叉的方向移动。后随链模板形成了一个回环，使环中RNA 引物和冈崎片段的合成方向与前导链一致，以适应双链在同一复制体上进行复制。特点：聚合酶和引发体联系在
50、一起可以协调它们的作用；复制体中的DNA Pol 是二聚体； 后随链是形成回环复制的。二、真核生物的复制、真核生物聚合酶和有关蛋白、真核生物复制特点：1 基因组中有多个复制起点；2 一般要等第一轮复制结束后第二轮才开始。3 真核的复制起点到两边的复制终点称为一个复制子或一个复制单位。DNA 开始合成的位置，一个初始起点 (或者双向复制起点-大多数起点是双向的)，两侧有一些二级起点。初始起点经常是0.5-2kbp长，而二级起点可跨越50kbp，因此称为起始地带4 真核和原核复制子的大小是非常相似的，但复制的速率真核要比原核慢得多；5 真核的复制起始点的数目和复制单位的大小是随着细胞的特点变化而改