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1、学号：20141147硕士学位论文基于TGF一13 1smad信号通路探讨扶正化瘀含药血清抑制肝癌细胞发生、发展的研究作者姓名 袁馨 申请学位级别 临床医学硕士学位指导教师姓名 薛博瑜学科专业 中医内科学职 称研究方向教授主任医师肝胆病临床研究学习时间自 2014年09月10日 起至 2017年06月30日止论文提交日期 2017年03月22日 论文答辩日期2017年06月07日学位授予单位 南京中医药大学 学位类型 临床医学专业硕士学位万方数据Fuzheng Huayu serum Suppresses hepaticcarcinoma cell Growth and Survival by
2、 targetingTGF-I lsmad SignalingA Dissertation Submitted for the MasterS DegreeCandidate：物an XinAdviser：ProfXue BoyuNanj ing University of Chinese Medicine，Nanj ing，China万方数据原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意
3、识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名： 弱w7年9垆学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。(请在以上方框内打“”)学位论文作者c需亲笔，躲街k芦拥刁日导师c需亲笔，签名：谢7年汐月口7日万方数据南京中医药大学硕士学位论文目录中文摘要一英文摘要一缩略词表绪论(前言)
4、正文第一部分理论研究第一章 祖国医学对肝癌的认识1病名及沿革2病因认识3病机认识4肝癌的中医药治疗进展第二章 现代医学对肝癌的认识一1概念及发病率2病程及发病机制3TGF131smad信号通路在肝癌中的作用一第三章 扶正化瘀方治疗肝癌的理论基础1扶正化瘀方治疗肝癌的理论依据2现代医家运用扶正化瘀法治疗肝癌3扶正化瘀方对肝癌的相关现代研究第二部分实验研究第一章、实验目的第二章、实验材料1药物及细胞株2主要材料与试剂3主要仪器与设备第三章、实验方法1细胞培养2MTT检测细胞增殖IIIIVVI1l222234777910lO11ll131313131313131415万方数据目录3克隆形成实验(Co
5、lony Formation)154FCM检测细胞凋亡165蛋白免疫印迹分析(Western Blot)176统计方法19第四章、实验结果一191、细胞增殖结果一192、细胞克隆形成结果一223、细胞凋亡结果一234、Westem Blot结果25第三部分讨论271、从扶正化瘀法论治肝癌一272、扶正化瘀方对肝癌细胞株的抑制作用一273、TGF131smad信号通路在肝癌发病中的作用一284、扶正化瘀方与TGF131Smad信号通路相关性285、总结及不足29参考文献30攻读硕士学位期间取得的学术成果32致 谢33II万方数据南京中医药大学硕士学位论文中文摘要研究背景：原发性肝癌是多发病、常见
6、病，恶性程度高、预后凶险，其发病机制十分复杂，主要包括毒物、炎症等导致的肝脏组织损伤，癌基因或抑癌基因突变，肝干细胞和肝癌干细胞作用等，其中90的肝癌发生发展基于肝脏慢性炎症。目前有研究发现TGF131smad信号通路参与损伤反应的多个方面：纤维生成，细胞的生长、抑制和凋亡，在肝癌的发展和侵袭中发挥重要作用。中医药可以通过多靶点、多途径作用，减轻患者临床症状，延长生存期，提高生存质量，为肝癌的临床治疗提供新思路。大量临床研究表明，扶正化瘀方不仅对肝纤维化具有显著疗效，而且对肝癌前病变有一定的作用。本课题通过体外实验研究扶正化瘀含药血清对肝癌细胞7701和7402的影响，探讨其抗肿瘤作用效果及潜
7、在的作用机制。研究目的：研究扶正化瘀含药血清对2种肝癌细胞株的抑制作用和扶正化瘀方对TGF131Smad信号通路的干预作用，探讨扶正化瘀方的体外抗肝癌作用及其可能存在的机制，以期为中药防治肝癌提供新的思路和科学实验依据。研究方法：以肝癌细胞株QGY-7701和BEL7402为研究对象，通过MTT实验、平板克隆形成实验、流式细胞凋亡术、Western Blot实验分别观察扶正化瘀含药血清对肝癌细胞株的增殖、集落形成能力、细胞凋亡和TGF131smad信号通路相关蛋白表达的干预作用。研究结果： (1)0520的浓度之间的扶正化瘀含药血清显著抑制人肝癌细胞QGY-7701和BEL7402细胞的增殖，
8、且具有浓度依赖性。(2)O520的浓度之间的扶正化瘀含药血清显著抑制人肝癌细胞QGY-7701和BEL7402细胞的集落形成能力。 (3)FCM凋亡检测发现，扶正化瘀含药血清处理后，人肝癌细胞QGY-7701和BEL-7402凋亡呈浓度依赖性增加。(4)扶正化瘀含药血清上调促凋亡蛋白Capase8的表达，上调肝癌细胞株中TGF131Smad信号通路相关蛋白表达，下调该信号通路下游靶基因肿瘤促进因子PAI1的表达。研究结论：扶正化瘀含药血清抑制肝癌细胞增殖和克隆形成，促进肝癌细胞凋亡，上调促凋亡蛋白Capase8蛋白的表达，干预TGF一131Smad信号通路相关蛋白表达。其抗肝癌作用机制可能是通
9、过干预TGF131Smad信号通路实现的。关键词：扶正化瘀含药血清；肝癌；QGY-7701：BEL7402；TGF一131Smad信号通路III万方数据些墨卫坠!ABSTRACTBackground：Primary liver cancer is a common and frequently occurring disease with ahigh degree of malignancy and an unfavorable prognosisIts pathogenesis is very complex，mainly including hepatic damage caused by
10、 poison and inflammation，oncogene or tumorsuppressor gene mutations，and theories of liver stem cells and liver cancer stem cellsTraditional Chinese medicine Can reduce clinical symptoms，prolong survival and improvequality of life in patients through multiple targets and pathways，providing new ideas
11、for theclinical treatment of liver cancerAt present，it has been found that the TGF-13 1smad signalingpathway is involved in many aspects of damage，and plays an important role in fibrogenesis，cellgrowth，inhibition and apoptosis，and the development and invasion of liver cancerAlso，considerable clinica
12、l studies have shown that Fuzheng Huayu(FZHY)decoction not only has asignificant effect on fibrogenesis，but also has a certain effect on precancerous lesions of liverInthis study，the effects of FZHY-serum on hepatocellular carcinoma cell(HCC)lines QGY-770 1and BEL-7402 were investigated through in v
13、itro expedments，tO explore its antitumor effect andpotential mechanismsPurpose：The inhibitory effect of the FZHY-serum on the 2 HCC lines and its interveningeffect on the TGF-13 1smad signaling pathway were studied，and its antitumor effect in vitro andpotential mechanisms were explored，in order to p
14、rovide new ideas and scientificallyexperimental basis for the prevention and treatment of liver cancer using traditional ChinesemedicineMethods：With HCC lines QGY-7701 and BEL-7402 cells as subjects，the interveningeffects of the FZHY-serum on HCC proliferation，colony-forming ability,apoptosis and th
15、eTGF-13 1smad signaling pathway were observed by MTT assay，plate clone formation assay，flowcytometry(FCM)and Western Blot，respectivelyResuits：(1)The FZHY-serum with a concentration of 05一20significantly inhibited theproliferation of HCC lines QGY-770 1 and BEL-7402，showing concentration dependencef2
16、)The FZHY-serum with a concentration of 05一20obviously inhibited the colonyformingability of human HCC linesFCM revealed that after treatment，the apoptosis of HCC linesQGY-770 1 and BEL一7402 presented a concentrationdependent increaseThe FZHY-serumup-regulated the expression of related proteins in t
17、he TGF-13 1smad signaling pathway inQGY-770 1 and BEL-7402，and down-regulated the expression of tumor-promoting factor PAl-1in the downstream of this signaling pathwayIV万方数据南京中医药大学硕士学位论文Conclusion：The FZHY-serum can inhibit the proliferation and colony-forming ability ofQGy0770 1 and BEL一7402，promot
18、e the apoptosis of QGY-770 1 and BEL-7402，up-regulate theexpression of pro-apoptotic protein Capase8，and interfere witll the expression of related proteinsin the TGF13 1smad signaling pathwayThe mechanism of its anti-hepatocarcinoma effect maybe mediated by the intervention of the TGF-13 1smad signa
19、ling pathwayKeywords：FZHY-serum；hepatocellular carcinoma；QGY-7701；BEL-7402；TGF-B1Smad signaling pathwaysV万方数据中英文缩略词表中英文缩略词表VI万方数据南京中医药大学硕士学位论文i上L一刖吾原发性肝癌(Primary Liver Cancer，PLC，以下简称肝癌)，在全球恶性肿瘤中，发病率排名第五，死亡率排名第三，5年生存率只有9。是临床常见病，多发病，且具有恶性程度高、预后凶险的特点。据相关统计显示，2012年全球范围内新发现大约782万例肝癌病例，而死亡人数高达745万，其中中国约占
20、发病人数的一半，发病率居世界第一位。据世界卫生组织(WHO)最新预测，全球性的肝癌发生率仍然将不断的攀升，预计到2030年时，肝癌将跃居肿瘤相关死亡原因的第二位。肝细胞肝癌(HCC)的预后凶险，几乎所有进展为HCC的患者，绝大部分都将在12个月内死亡，据有关人口调查统计，在许多国家，肝癌的新确诊率与死亡率几乎相等，由此可见，HCC的临床治疗及预后极不乐观。目前认为肝癌的发生发展是一个多因素、多阶段的过程，其发病机制主要包括：由病毒感染、有毒物质或代谢因素导致的肝脏组织损伤，原癌基因和抑癌基因的博弈失衡，异常活化的分子信号通路，肿瘤干细胞作用等。现代医学治疗原发性肝癌以外科手术为首选，肝移植是目
21、前唯一能治愈肝癌的方法：经导管动脉化疗栓塞术是当前中晚期肝癌非手术患者的首选；索拉菲尼作为分子靶向药物，是首个被批准用于治疗晚期肝癌的标准药物。然而上述治疗措施仍避免不了适应症患者有限、创伤大、风险高、术后并发症棘手及复发、不良反应多等诸多问题。近年来大量的临床研究报道证实了中医药治疗原发性肝癌的新发现及新思路，中医药己不仅仅作为肝癌保守治疗的方法，而是渐渐成为主要治疗手段之一，能明显减轻患者临床症状，延长生存期，提高生存质量。越来越多的实验研究己证实了多种中药的抗肿瘤作用，并深入探究中医药治疗本病的机理，以求为原发性肝癌找到新的治疗靶点。扶正化瘀方由冬虫夏草、丹参、桃仁、五味子、绞股蓝及松花
22、粉组成，具有化瘀解毒、疏肝活血、提高免疫力、益精养肝的功效，临床治疗慢性乙肝肝纤维化疗效确切。研究发现，扶正化瘀方具有保护肝细胞、抗肝纤维化，抑制肝细胞异常增生及干预肝癌癌前病变等多重作用，但扶正化瘀方如何干预肝脏癌变的进展，以及是否通过TGF-131Smad信号通路实现其作用，其机制尚待进一步研究。万方数据第一部分理论研究第一部分 理论研究第一章祖国医学对肝癌的认识1病名及沿革祖国医学历代文献中并无“肝癌”之名，但有关“肝积”、“肝著”、“肥气”、“癖积”等描述与其类似。现代医家普遍认为肝癌多属于中医的“积聚”、“瘸瘕”范畴。主要表现为：右胁疼痛，腹部结块，腹胀大，黄疸，纳差，乏力，消瘦等，
23、肝癌的上述相关症状可追溯于诸多的中医经典著作中，在灵枢邪气脏腑病形中首次对本病的病名、病位、病性进行了论述，其日： “肝脉急甚为恶言，微急为肥气，在胁下若覆杯”。 诸病源候论积聚候：“诊得肝积，脉弦而细，两胁下痛”。 难经五十六难提出了“五脏之积”的理念，其日“肝之积名日肥气，在左胁下，如覆杯，有头足。久不愈，令人发咳逆，疹疟，连岁不己”，由此可见肝积为胁下肿块，伴有疼痛，久不愈合，这与肝癌的表现极为相似。 诸病源候论积聚病诸候积聚瘤结候亦对肝癌的病因病机了相关的阐述： “积聚瘤结者，是五脏六腑之气己积聚于内，重因饮食不节，寒温不调，邪气重沓，牢瘤盘结者也，若久即成症”；也提出“积者阴气，五脏
24、所生，始发不离其部，下有所穷己。诸脏受邪，初未能为积聚，留滞下去，乃成积聚”；“虚劳之人，阴阳伤损，血气凝涩，不能宣通经络，故积聚于内也”提出了虚劳之人易产生积聚的观点。宋代圣济总录云：“积气在腹中，久不差，牢固推之不移，有症也。按之其状如杯盘牢结，久不己，令人身瘦而腹大，至死不消”，对肝癌难治性、预后较差等都作了较为细致的观察。张景岳在景岳全书积聚中提出肝癌的病机演变： “病变之初多为肝气郁结，日久则气滞血癖，各种病理因素胶结，成有形之质。”及其严重程度： “若痛有至极不可忍者，乃血竭不能荣筋，此肝脏之败也，必死”，又如树后备急方治卒心腹症坚方中“治卒暴腹中有物如石，痛如刺，昼夜啼呼，不治之
25、，百日死”，则对肝癌晚期的临床表现进行了描述。因此，现代医学的肝癌可根据症状归为”“积聚”、“瘸瘕”等疾病范畴。2病因认识总结历代医家对积聚病因的认识，可将其归纳外感、内伤两类，主要包括正气虚弱、情志不畅、饮食失宜、外邪入侵、病后续发五类，其中以正气亏虚为发病的内在根本因素。21正气虚弱“邪之所凑，其气必虚”，正气亏虚是肝癌发病的内在因素，禀赋薄弱，或后天失养，正气亏虚，不能抵御外邪侵袭：或他病日久，耗伤正气，导致阴阳失调，气血逆乱，脏腑功能紊乱，瘀血留滞不去，而成积聚。 杂病源流犀烛日：“皆肝家气血两虚，肝气不2万方数据南京中医药大学硕士学位论文和，逆气与癖血相并而成”，认为肝脏之气血亏虚而
26、致肝气不足为发病的原因。张元素活机机要所述：“壮人无积，虚人则有之。脾胃怯弱，气血两衰，四时有感，皆能成积。”可见脾虚是肝积的关键，并且贯穿其始终，又因“乙癸同源”，肝癌发病主要以肝、脾、肾三脏为主。22情志不畅金匮翼积聚统论日：“凡忧思郁怒，久不得解者，多成此疾”，可见情志不舒，喜怒无常，善疑易惊，忧思脑怒等精神情志刺激，均可致气机不畅，脏腑失和，脉络受阻，血运受阻，气滞血瘀，日积月累致积聚。23饮食失宜嗜酒肥甘，过饥过饱，饮食不节，可致脾胃受损，运化失常，不能正常输布运化水谷精微，食滞湿浊凝而为痰，进一步化为痰湿、痰饮，气机壅志不畅则成聚证，如痰湿气血搏结，脉络瘀阻，日久成积证。 景岳全书
27、痢疾论积垢日： “饮食之滞，留着于中，或积聚成块，或胀满硬痛，不化不行，有所阻隔者，乃为之积”。24外邪入侵湿热瘀毒之邪留滞经络，内聚脏腑，致使气滞血瘀，进而损伤气血，肝肾亏虚，日久而成此病。金匾翼积聚统论论述了外感邪实致使积聚发病的观点，故有“积聚之病，非独痰食气血，。即风寒外感亦能成之之说。其中湿热瘀毒为主要病理因素：情志不遂，气郁化火，火郁为毒：或脾胃素虚、肝郁乘脾，运化失常，聚湿生痰，湿热结毒，形成肝积。25病后续发肝脏或者其他脏腑的疾病在疾病后期，因为一系列病理变化也会变生肝癌，如胁痛、黄疸日久，湿邪久留，阻滞气血；或感染血吸虫等虫毒，肝脾失和，气滞血瘀；或痢疾、泄泻久发不愈，脾失运
28、化，肺失转输，血液运行不畅，均可发为积聚之病。3病机认识肝癌为病，总属本虚标实，正气不足、脏腑失调为肝癌发病的内在基础，湿热瘀毒互结为发病的关键因素，病位主要累及肝脾肾三脏。31正气不足、脏腑失调是发病的内在因素万方数据第一部分理论研究所谓“正气存内，邪不可干”，正气亏虚是肝癌发病的前提和依据，发病与否主要取决于正气的盛衰，正气相对虚弱，卫外不固，抗邪无力，邪气方能乘虚而入，所谓“邪之所凑，其气必虚”。邪气多在机体正气不足，抗邪无力时侵入人体肌肤；或因正气亏虚，脏腑功能失调，精气血精液失常而导致发病。肝癌为病，主要与肝脾两虚，肾气不足有关。景岳全书云： “凡脾。肾不足及虚弱失调之人多有积聚之病
29、，盖脾虚则中焦不运，肾虚则下焦不化，正气不行，则邪滞得以居之”。 内经云“人之善病肠中积聚者，皮肤薄而不泽，肉不坚而淖泽，如此则肠胃恶，恶则邪气留止，积聚乃伤”。又如隋代巢元方诸病源候论积聚病诸候所言“积聚者，由阴阳不和，脏腑虚弱，受于风邪，搏于脏腑之气所为也”，认为积聚多由脏腑虚弱所致，为积渐而成。同时正气不足、脏腑失调既是肝癌发病的病因亦是外邪侵袭盘踞的根源，正气不足，其抗邪能力不足，致使邪气更易侵犯人体，终致虚虚之虞之境地。32湿热瘀毒互结为发病主要病理因素肝癌为病，责之肝之阴阳失调，或肝气阻滞、郁而化火、火盛伤阴，或气机阻滞而致血瘀、瘀毒交阻蕴结，或气机郁滞，湿阻内阻、湿毒相互蕴结，着
30、而不去，日久而成积块，肝脾两虚夹湿热瘀毒之邪是肝癌发病的基本病机。主要表现为气滞、血瘀、痰湿、热毒等相互蕴结，凝阻脉络，隐伏于血分，胶着于肝体，迁延日久变生癌毒，发为癞积。其中以“湿热瘀毒”之邪为主，贯穿整个肝癌病程的始终。周仲瑛教授的“癌毒”理论认为癌毒是导致肿瘤发生的一种特异性致病因子，与其他病邪形成复合病机共同致病，如恶性肿瘤患者临证常见湿毒、瘀毒、热毒等复合病机【l】。另外正虚与邪实绝非单独存在，而是相互转化，癌体渐成，则耗竭机体精微以充其以自养，致使机体迅速耗竭；正气亏耗，无力抵御邪实，而癌毒愈胜，进一步耗伤正气，最终导致毒猖正竭【2】。肝癌发病是一个长期积渐而成的复杂病症，在正虚湿
31、热瘀毒留结转化的病理过程中，常因外感六淫、情志变化、饮食失宜、劳逸适度及患者体质强弱等因素演变转化为不同的病理性质，如湿热邪毒聚集于上者，多见风、火、热：聚于下者，则多为寒、湿，但不管如何转化演变，湿热瘀毒之邪始终附着在肝癌发病的局部病位，故而肝癌致病总以正气亏虚，脏腑失调，湿热瘀毒互结为主要病机。4、肝癌的中医药治疗进展41辨治要点411扶正祛邪，补泻适宜扶正祛邪是中医基本治则之一，所谓“正气存内，邪不可干”，正气先亏，而后邪气凑之是本病发病的基础，故扶正法在治疗中有重大意义，应首先辨明气血阴阳之虚损，调4万方数据南京中医药大学硕士学位论文和阴阳，化生气血，促进人体的免疫功能及抗癌能力。薛博
32、瑜教授【3认为“毒邪去，似釜底抽薪，可顿挫病势，兼夹之邪随之而消”，强调清化肝经湿热瘀毒，善用凉血和血、化解肝毒、化瘀滞、通肝络等治法。肝癌既有毒瘀之实，又有气血亏损之虚，应慎重权衡，补虚泻实兼而用之。肝癌初期，以疏肝理气、解毒散结为主；中期宜攻补兼施；后期正气亏损愈渐，治以扶正为主，兼以解毒利湿、化瘀散结，达到攻补兼施，补泻适宜的目的。412气血同治，重在疏通本病发病多基于肝气郁结、气滞血瘀，瘀毒结块，耗伤正气，因此治疗本病宜疏通气血，条达为要，如素问至真要大论所云： “疏其气血，令其条达，而致和平”。肝喜疏泄条达而恶抑郁，郁则气滞、气逆、久则血瘀，因此不管处于什么阶段，始终贯彻疏通气血的基
33、本治则。肝调节人体一身之气机，脾乃中土，为气机升降之枢纽，故治疗肝癌应以调理气机为先，气行则血行，气行则湿化。遣方用药，多用八月扎、柴胡、青皮、绿萼梅之类，辛开理气，不损胃、不耗气、不伤阴。肝气郁久而气滞血瘀，治应疏肝理气，活血化瘀，近期的医学研究提示41，大多数的肝癌患者血液均处于高凝状态下，而通过活血化瘀的中药或中成药予以治疗后，高凝状态得到了较好的改善，对于疾病的康复非常的有利。常用的化瘀软坚药有：赤芍、炙鳖甲、当归、丹参、大黄、三七、郁金、炮山甲、生牡蛎、夏枯草等。治疗时亦有轻重之分，轻则理气养血活血合用，配伍郁金、丹参、当归等：重则理气活血化瘀同用，配伍赤芍、莪术、泽兰等；若瘀阻脉络
34、，则宜和肝通络，宣通而不辛窜，化瘀而不峻猛；陈旧性瘀血、难破之血宜用虫类药，其攻逐瘀血力量强，以毒攻毒，搜经剔络【5】，且很多虫类药既可活血又有解毒功效，为临床医所喜用，如：全蝎、蜈蚣、斑蝥等。肝癌晚期患者须合理使用活血化瘀之剂，宜活血不宜破血，恐有出血之弊，或使癌毒扩散之嫌，故三棱、水蛭、山甲、皂角刺等破血逐瘀之品宜少用，防其耗散正气。临床常用：乳香、没药、桃仁、红花、延胡索、大黄、虎杖、川芎、三七、石见穿、丹皮等；若肿块明显而体质较强者，可适当加用三棱、莪术，张锡纯认为此二药“既善破血，尤善调气”，于补药剂中用之，“将有瘀者可徐消，即无瘀者亦可借其流通之力，以行补药之滞，而补药之力愈大也”
35、6，其常与党参、白术、黄芪相配伍。413病症不离，解毒散积肝癌的病情进展快，且极易出现侵袭，很多患者在明确时均己出现了多脏器的转移，单纯采用中医辨证治法抗癌抑瘤的效果并不理想，因此要注意辨病与辨证相结合的治疗原则，选用具有一定解毒抗癌作用的中药进行“辨病”治疗至关重要。辨病用药直接作用于肿瘤，与化疗药物的“细胞毒”作用类似，经现代研究表唰，】中药抗肿瘤的机制包括：从肝癌细胞出发：促进凋亡、防止多药耐药、抗突变；从机体出发：提高机体免疫能力。常万方数据第一部分理论研究用抗癌解毒药有：猫爪草、八月扎、白花蛇舌草、半枝莲、山慈菇、老鹳草、土茯苓、炙蜈蚣、蜂房、漏芦、炙蟾皮等。除了强调解毒法之外，散积
36、法在辨治肝癌中也具有重要作用，如程钟龄所言：“消者，去其壅也，脏腑经络之间，本无此物。而忽有之，必有消散，乃得其平”。在临证时除了通过驱逐的手段将入侵的外邪排出体外，更优的选择是通过“消”的手段使邪气在体内瓦解，并最终化于无形，以防攻伐药滥用之弊。朱丹溪论积证：“在左为血积，在右为食积，在中为痰积。”散积当从以下四个方面着手：一、消食散结法，通过消食药如：焦山楂、焦神曲、莱菔子、半夏曲、麦芽曲、枳实、厚朴等消食行气化积，去除积滞，用药缓和不伤正气。二、软坚散结法，内经中很早就提出了：“坚者消之结者散之”的治法，因“咸能软坚”，故一般选用昆布、海藻、牡蛎、夏枯草、瓦楞子、炙鳖甲等。三、化瘀散结法
37、，瘀为肝癌的重要病理基础之一，血液瘀积形成血积证，常用药如莪术、当归、赤芍、三棱等，由于气滞实为各种瘀血证的病变基础，而肝主疏泄，故薛教授临证常选用一些引入肝经的药如佛手、枸桔李、川楝子、郁金、八月札、青皮、陈皮等配伍使用。四、化痰散结法，痰不仅是致病病因，同时也是其他病因所致的病理结果，是肿瘤发病的关键因素之一，其胶着粘腻之性是肿瘤难以消散的重要原因，不仅可以治疗肝癌，而且可以改善组织环境，常用药如：浙贝母、半夏、天南星等。42成方专方杜标炎等8】对六味地黄丸进行研究发现，小鼠移植性肝癌自杀基因在用药组具有一定的增效性，优于单纯自杀基因疗法组和单纯六味地黄丸治疗组。进一步研究发现六味地黄丸含
38、药血清对自杀基因系统10tk+GCV杀伤大鼠肝癌CBRH 7919细胞具有协同增效作用，且有一定的量效关系。陈鹊汀等9】研究认为当归补血汤对化疗药物5Fu抗小鼠H22肝癌具有增效减毒的作用，发现当归补血汤可以提高实验小鼠肝癌细胞的抑瘤率，而且具有减少化疗药物药物反应的作用，如胸腺和脾脏萎缩，血细胞、骨髓有核细胞减少，化疗后H22小鼠脾脏NO和小肠MDA的含量也显著降低。林奕堂【lo】运用宣肺温肾利水法治疗肝癌腹水30例获得良好疗效，处方：桑白皮、紫苏叶、白术、获荃皮、山药、大腹皮、黄蔑、土鳖虫、半枝莲、娱蛤、附子、肉桂。研究发现：总有效率为867，其中显效15例，有效11例，无效4例。43其他
39、疗法金琦等【11】以中药内服加外敷法治疗脾虚血瘀型肝癌腹水60例。将制甘遂99，砂仁99，冰片39，研为细末，与芒硝2509混合拌匀，放进15cmxx20cm大小的纱布袋内，敷于脐部，以神阙穴为中心，晚间至次日凌晨每日使用，待药物潮解后去除，清洁用药处皮肤，连续使用15天。研究结果表明：中药内外同治对晚期肝癌腹水脾虚生癖型患者总有效率为533，具有确切的疗效，且能够缓解腹胀腹痛、乏力纳差，恶心呕吐等症状，提高患6万方数据南京中医药大学硕士学位论文者生存质量。吴毅军【12】用针灸联合三阶药物疗法治疗肝癌疼痛，将54例原发性肝癌疼痛患者随机分为联合治疗组、针灸治疗组(取双曲泉、双肝俞、双心俞、大椎
40、7穴进行阻滞针法治疗)、药物对照组，结果显示针灸联合三阶药物治疗肝癌疼痛疗效最佳，优于三阶药物单独疗法治疗和针灸疗法治疗，且不良反应较小。第二章现代医学对肝癌的认识1、概念及发病率原发性肝癌是恶性程度高、预后凶险的肿瘤病变，是男性第五大及女性第七大常见肿瘤，是全球性的健康问题【13】。在全球范围的统计中，肝癌的发病率处于恶性肿瘤的第五位，其死亡率则位居第三，5年生存率仅仅只有9。据相关统计，2012年全球范围新发现782万例肝癌病例，而死亡人数达到745万，其中发生在中国的约占50【14】。据世界卫生组织(WHO)预测，全球性的肝癌发生率仍然将不断的上升，预计到2030年时，肝癌将成为肿瘤相关
41、死亡的次要原因【15】。原发性肝癌有三种分型，分别为肝细胞型肝癌，胆管细胞型肝癌以及混合型肝癌这三种类型，其中最常见的分型是肝细胞肝癌。包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)在内的病毒性肝炎、酒精性肝炎(alcoholichepatitis)及非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fattyliver disease，NAFLD)和黄曲霉等是公认的肝癌发生的致癌因素。在我国，慢性乙型病毒性肝炎是导致肝癌发生的主要病因。2、病程及发病机制21由病毒感染、有毒物质暴露或代谢导致的肝脏组织损伤肝细胞的损伤及死亡多是由病毒、化学毒
42、物以及过度代谢导致的。肝细胞的损伤后会导致一系列的分子反应以及细胞反应，进而清除或修复损伤细胞、抵抗感染、促进局部组织修复与再生。慢性肝炎致肝癌是其中作重要的机制之一，目前认为肝癌的发生发展是一个多因素、多阶段的过程，超过90的肝癌发生发展基于肝脏的慢性炎症：接触传染性病原体(肝炎病毒)或有毒物质(二乙基亚硝胺、AFBI)会诱发慢性肝损伤和炎症反应。慢性坏死性炎症是导致癌变的关键：炎症细胞激活的活性氧(ROS)和活性氮中间体(RNI)能引起周围上皮细胞的突变，同时其所产生的细胞因子能够使癌前病变细胞中ROS和RNI的含量上升，炎症导致表观遗传变化，这些导致了肿瘤的发生。只有认识到炎症在肿瘤发生
43、机制中的重要性，对预防及控制炎症产生重视，那么很多肿瘤都是可以早期预防的。而作为肝癌高发地区，如何阻断慢性肝病到肝癌病程，预防、减少、治疗慢性炎症所致肝癌，已经成为亟待解决的科学问题。22癌基因或抑癌基因单个或多个的突变万方数据第一部分理论研究肝癌发生的主要机制是原癌基因与抑癌基因的对抗，包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活两个部分。原癌基因可以使细胞进入增殖周期，阻止其分化、凋亡，对细胞的分化发挥正调控作用，一般在正常细胞中不表达或低水平表达。在但受电外界致癌因素(如离辐射、损伤、化学诱导等)刺激后，原癌基因会发生突变从而转化为癌基因，从而导致细胞恶化，在肝癌中，Nras基因以及HBVx基因是
44、主要的原癌基因【16】。抑癌基因作为肿瘤的易感基因或隐性基因，又叫做抗癌基因，其存在于正常细胞中，能够制约癌基因，并与其共同调控细胞的生长、分化，主要抑制细胞进入增殖周期，同时诱导终末细胞分化以及凋亡，从而抑制肿瘤的生长，维持基因的稳定，在肝癌中，p53，Rb基因等是主要的抑癌基因171。23异常活化的分子信号通路肿瘤相关信号转导通路近年来一直是研究的热点，也为分子靶向治疗提供了理论基础。以下几种经典的信号转导通路的异常活化参与了肝癌的发生与发展。231 Wnt信号通路WntD-catenin信号通路成员的基因突变和(或)异常表达奠定了肝癌细胞增殖、转移和侵袭的分子生物学基础。经典Wnt通路包
45、括Wnt蛋白、跨膜受体(卷曲蛋白以及低密度脂蛋白受体相关蛋白)、胞质蛋白、下游靶基因、核内转录因子等组成。正常情况下，Wnt3一catenin信号通路仅在胚胎轴的分化、细胞的再生和器官的发育等过程中发挥短暂作用，而出现异常持续性表达时，则其发生于与恶性肿瘤的发展相关联。232 Hedgehog(Hh)信号通路Hedgehog信号通路作为关键调控通路在肝癌形成中起重要作用，Hedgehog信号通路在哺乳动物中由Hedgehog配体、跨膜蛋白受体、下游转录因子Gli以及目的基因等组成。当信号通路被激活时，Hh配体与跨膜蛋白受体Ptch相结合，使Ptch对于Smo的抑制效应被解除，随后在细胞质内，Smo进一步激活转录因子Gli，从而使目的