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1、雷公藤甲素微乳凝胶对CIA大鼠T细胞相关因子调节作用研究 组织脱水机;BMJ-型包埋机;PHY-型病理组织漂烘仪;数码三目摄像显微镜等;图像分析软件Image-Pro Plus 6.0。 1.2 方法 1.2.1 分组与模型制备 雄性SD大鼠适应性饲养1周后，随机选取8只作为空白比照组，其余进行造模。将牛型胶原蛋白与弗氏完全佐剂在冰浴条件1 1乳化，形成稳定的乳化剂。在大鼠尾根部2 cm处注射乳化劑0.2 mL/只，7 d后在离大鼠尾根部1.5 cm处注射乳化剂0.1 mL/只再次免疫1次。 从初次免疫第1天起，每日视察四肢肿胀状况，根据04级评分标准进行评分5，0分：无关节炎;1分：小趾关节
2、轻度肿胀;2分：小趾关节和足跖肿胀;3分：踝关节以下的足爪肿胀;4分：包括踝关节在内全部关节肿胀。四肢评分之和为关节炎指数，AI越高，表明关节炎程度越严峻。初次免疫后第14天进行关节炎指数评分，AI4即为造模胜利，将AI评分不足大鼠剔除，最终随机选取56只CIA模型大鼠进行试验。将56只CIA模型大鼠，按评分梯度匀称分为模型组、基质组、TP灌胃组、TP微乳高剂量组、TP-MBGs高、中、低剂量组，每组8只。 1.2.2 给药方法 空白比照组和模型组正常饲养，TP灌胃组灌胃给药，其余各组均涂在患病关节部位，给药量见表1，1次/d，连续给药28 d，为便利给药各组大鼠给药部位定期进行剃毛处理。 1
3、.2.3 检测指标与方法 1.2.3.1 大鼠皮肤组织CD1、IgA平均吸光度的测定 取大鼠皮肤，4%多聚甲醛固定后均按病理检验SOP程序进行。脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最终镜检。采纳BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统显微摄像系统对切片进行图像采集，每张切片先于101倍下视察全部组织，再依据组织大小及表达状况分别选取1个区域400倍采集图像。采纳Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定所采集全部图像的吸光度，并计算其平均值。 1.2.3.2 采纳酶联免疫吸附法测定大鼠血清中IFN-、IL-6、TNF-、Col、IL-10的水平 各组大鼠采纳10%水合氯醛腹
4、腔麻醉，于腹主动脉取血，室温放置1 h，取上清液2 000 r/min离心10 min得血清。采纳ELISA法检测血清中Col、IFN-、IL-6、IL-10、TNF-的含量，其操作过程根据试剂盒供应的方法进行。 1.2.3.3 采纳ELISA法测定大鼠滑膜细胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-水平 在无菌条件下，取各组大鼠膝关节滑膜组织，用D-hanks液洗涤3次以去除血细胞，细致剔除脂肪组织后，获得较纯的白色滑膜组织块。剪成约12 mm2大小，型胶原酶消化3 h后，离心收集未贴壁的细胞，经0.25%胰蛋白酶消化5 min，离心弃去上清液，将细胞重悬于含15%胎牛血清的DMEM培育液中，置
5、37 5% CO2条件下培育48 h，离心收集上清液，-80 冰箱保存备用。根据试剂盒说明测定滑膜细胞上清液中IL-1、PGE2、TNF-的含量。 1.3 统计学方法 采纳SPSS 21.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以表示，采纳2检验，计量资料以表示，采纳t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 TP对大鼠皮肤组织CD1、IgA平均吸光度的影响 模型组与空白比照组比较，CD1表达水平明显上升，且差异有统计学意义;其余各给药组与模型组比较，CD1均有降低趋势，其中TP灌胃组和TP-MBGs高剂量组降低程度明显，基质组与模型组几乎相等，而IgA的表达在各组之间差异
6、无统计学意义。见表2。 2.2 TP对大鼠血清中IFN-、IL-6、TNF-、Col、IL-10水平的影响 模型组与空白组比较，大鼠血清中IFN-、IL-6、TNF-水平均上升，差异有统计学意义，而Col与IL-10无统计学意义;基质组与模型组比较，各因子水平几乎相等;其余各组与模型组比较，TP灌胃组、TP微乳高剂量组及TP-MBGs高剂量组中IFN-浓度显著性降低，TP-MBGs中、高剂量组及TP灌胃组的TNF-水平显著降低，TP灌胃组及TP-MBGs中剂量组的IL-6的水平显著降低;Col和IL-10的水平无明显改变，差异无统计学意义。见表3。 2.3 TP对大鼠滑膜细胞上清液中IL-1、
7、PGE2、TNF-的影响 模型组与空白组大鼠比，滑膜细胞上清液中IL-1、PGE2及TNF-的含量均有上升，差异有统计学意义;基质组与模型组比较，IL-1、PGE2、TNF-水平几乎相等，差异无统计学意义;而与模型组比较，TP灌胃组、TP-MBGs高、中剂量组及TP微乳高剂量组中IL-1、PGE2及TNF-的含量均降低，差异有统计学意义。见表4。 3 探讨 CIA模型在临床表现、病理组织学及体液免疫反应方面与RA有诸多相像之处，是目前复制RA最佳的动物模型6-7，故本试验选择CIA為RA的动物模型进行探讨。树突状细胞是目前所知功能最强的抗原提呈细胞，它的数量和活性将会干脆影响免疫应答过程，从而
8、干脆参加RA的发展过程。CD1是树突状细胞的特征性抗原，在皮肤中大量表达并发挥免疫作用8。本试验结果表明，模型组与空白比较，CD1的表达水平显著上升，而TP灌胃组，TP-MBGs高剂量组与模型组比较，CD1的表达水平显著降低，说明在制备大鼠类风湿关节炎模型后，免疫功能出现异样，树突状细胞表达水平上升，RA的发展与树突状细胞的表达亲密相关，而TP-MBGs外用可通过下淘气肤中CD1的表达水平从而起到治疗RA的作用。 RA是自身免疫性疾病，因此对血液和关节滑膜细胞中的细胞因子进行探讨，其中IL-6是一种重要的多效性细胞因子，由体内多种细胞分泌，是RA的关键细胞因子。它对RA的主要致病作用包括促进炎
9、性反应相关的B细胞和Th17细胞的分化以及急性期蛋白的合成;诱导破骨细胞分化，造成关节损伤;与IL-1共同诱导基质金属蛋白酶的产生，破坏关节软骨等9。在RA患者血清及受累关节的滑液中均可视察到IL-6浓度上升，并且浓度上升与患者临床表现的轻重相关10。TNF-是一种多效性的细胞因子，是RA发病过程中主要的促炎因子，被认为是与RA滑膜炎性反应的发生和发展关系最亲密的促炎递质，在RA的局部滑膜炎性反应、血管翳的生成和组织损伤中都发挥了重要作用，可作为疾病活动度的重要指标。本试验中，空白组与模型组比较，大鼠血清中IL-6、TNF-及IFN-的水平显著上升，表明RA的发病过程与炎性反应因子的水平亲密相
10、关。TP灌胃组与TP-MBGs中剂量组相较于模型组，IL-6水平显著降低;TP灌胃组、微乳高剂量组及TP-MBGs高剂量组的IFN-浓度较模型组显著降低;与模型组比较，TP灌胃组及TP-MBGs中剂量组的TNF-的表达水平显著降低。表明TP-MBGs外用可通过降低血清中相关炎性反应因子，发挥全身作用，从而达到治疗RA的效果。 在机体处于炎性反应状况下，IL-1被大量表达，它的2种亚型IL-1和IL-1在介导炎性反应和免疫过程中发挥重要作用。适量的IL-1可以增加机体抵挡外界入侵的实力，而过多IL-1则引起关节损害，表现出类似RA的症状。在RA发病中IL-1可以刺激成纤维细胞增殖和血管翳生成，诱
11、导产生更多PGE2，引起白细胞向滑膜部位聚集以及金属基质蛋白酶、胶原酶的分泌，加剧关节破坏11。本试验中，较空白组，模型组大鼠滑膜细胞上清液中的IL-1、PGE2及TNF-的水平明显上升;较模型组，TP灌胃组、微乳高剂量组、TP-MBGs中、高剂量组的IL-1及TNF-水平显著降低;TP灌胃组、TP-MBGs中剂量组及TP-MBGs高剂量组中PGE2浓度明显降低。基质组与模型组差异无统计学意义，说明基质对RA不产生影响，表明TP-MBGs可降低局部滑膜细胞中的致炎因子，且TP-MBGs与灌胃组效果相当，这可能是其外用治疗RA的作用机制之一。 综上所述，TP-MBGs外用治疗RA，可能通过调整皮
12、肤免疫功能及抑制相关细胞因子的分泌，从而起到局部及全身治疗作用。TP-MBGs外用与TP口服相比效果相当，均有肯定的治疗效果。其中微乳凝胶基质对RA无明显的治疗效果TP-MBGs较TP微乳指标更趋向于空白比照组，治疗效果更好。 参考文献 1Molendijk M，Hazes J M，Lubberts E.From patients with arthralgia，pre-RA and recently diagnosed RA：what is the current status of understanding RA pathogenesisJ.RMD Open，2022，4：1256-12
13、62. 2潘胡丹，刘良.类风湿关节炎中医治疗阅历探讨J.中医杂志，2022，57：173-175. 3胡晓敏，宗英，余珊珊，等.类风湿关节炎治疗药物的研发进展及趋势J.中国新药杂志，2022，26：36-43. 4邓兆智，陈伟，史立，等.复方雷公藤涂膜剂治疗类风湿性关节炎的对比探讨J.中医杂志，19101，2：90-92. 5刘佳维，王永辉，李艳彦，等.黄芪桂枝五物汤对CIA模型大鼠关节滑膜细胞凋亡的影响J.中国试验方剂学杂志，2022，23：173-176. 6周强，吕厚山，栗占国.胶原诱导的关节炎动物模型探讨现状及进展J.中华风湿病学杂志，2003，7：227-231. 7姜旭光，姜明霞，
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