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1、木质素过氧化酶对双酚A类化合物的分子动力学模拟 打开文本图片集 摘要：为了解双酚A类化合物与木质素过氧化物酶结合位点的结合构象及其相互作用机理，采纳SYBYL-X1.3中分子对接的方法对BPA、BPF、BPAF、BPQ、BPB、BPC、BPS、BPE、BPAP等具有突出特点的双酚A类化合物与LiP进行对接探讨，并利用GROMACS软件进行分子动力学模拟。通过对对接最稳定化合物BPQ和常用化合物BPA的模拟参数详细分析，找到了LiP的活性位点为HIS39、MET173、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46；找到了该酶被识别的氢键
2、结合位点中的氨基酸残基，BPQ通过氢键连接了PRO83.O、ASP183.OD2和ASN182. HD21，而BPA通过氢键连接了PRO83.O、ARG43.HH21。氨基酸残基对LiP与双酚A类小分子化合物的降解起到重要作用。 关键词：木质素过氧化物酶；双酚A；分子对接；分子动力学模拟 中图分类号：Q554 文献标识码：A 文章编号：0439-811401-0220-06 DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2022.01.058 双酚A类化合物是一种类雌激素，在塑料制品生产过程中可作为阻燃剂、抗氧化剂、硬化防止剂、聚合抑制剂和增塑剂等1，在水杯、奶瓶、食品包装、饮料
3、容器、医疗设备上被广泛运用，且越来越多地应用在新产品的开发上。由于其难降解，该类化合物会缓慢地释放到四周的环境中，并在环境中积累，通过空气、水、土壤以及食品污染物等途径引起人体畸形、癌变、内分泌失调、新陈代谢紊乱2，3，成为了继“温室效应”，“臭氧层空洞”后第三大威逼人类健康的热点。因此，找寻并用正确的方法处理环境中的双酚A类化合物已迫不及待。 作为木质素生物降解过程当中的酶类，木质素过氧化物酶以过氧化氢为电子受体并以铁扑啉作为辅基，其催化反应遵循传统过氧化或者氢氧化催化机理4。11018年Tien等5首次从白腐真菌属的黄孢原毛平革的限制性培育基中发觉了LiP并且认定该酶为氧化还原酶。探讨发觉
4、，LiP的作用底物比较广泛，主要有酚类和非酚类芳香化合物质，也包括苯并芘等多环芳烃6。 分子对接是探讨小分子与大分子物质相互作用模式、生物大分子之间的相互识别的常用方法之一7。分子动力学模拟是利用计算机软件对生物或化学反应的过程进行模拟，还可以用来预料蛋白质的结构、探讨酶促反应的过程与机制以及蛋白质与小分子的相互作用机理等，为某些酶促反应、药物设计与药理作用探讨供应理论依据8，9。林锦霞等10用分子对接的方法探讨了短小芽孢杆菌木聚糖酶与底物木聚糖的作用，也有学者利用分子对接和分子动力学模拟的方法探讨蛋白质配体和受体的作用机理11。目前，有关LiP催化降解双酚A类化合物的探讨鲜见报道。因此，本探
5、讨选取了几种常见的双酚A类化合物，利用分子对接软件和分子动力学模拟软件，将LiP与几种小分子双酚A类化合物进行对接，找寻酶的活性位点，并对对接效果最好的小分子物质进行动力学模拟，了解其相关作用机制，为LiP催化代谢双酚A类化合物供应理论指导。 1 材料与方法 1.1 数据来源 试验中选取的9种化合物包括：2，2-双丙烷、4，4-二羟基二苯基甲烷、2，2-二-六氟丙烷、2，2-双丙烷、2，2-二丁烷、4，4-双、4，4-二羟基二苯砜、4，4-亚乙基双苯酚、4，4-双酚，其共同特点就是具有两个或多个芳环并共同连接到一个中心C上，各种化合物的结构式如图1所示。 1.2 计算及模拟方法 LiP在RCS
6、B Protein Data BankRCSB PDB中有多种构型，本试验参照冯义同等12关于LiP催化去除水中雌激素的探讨，选取酶晶体结构1B82，以此物质作为分子对接和动力学模拟的蛋白质受体。 LiP与双酚A类化合物的分子对接：分子结构进行能量最小化的优化，采纳最陡下降法-共轭梯度法13，设置能量收敛值为0.005 kJ/，优化次数设置为1 000，最终进行加电荷并负载Gasteiger-Hckel电荷14。为了探讨的简化，除去LiP中两条完全对称的B链中的一条，为蛋白质加载电荷加氢，固定全部的氢原子。采纳AMBER7 FF101力场对蛋白质进行修复和能量最小化优化。对接过程以CH4、C=
7、O、N-H为分子探针，指定原型分子的探测方式为配体，阈值默认值为0.5，其他参数为默认值15，进行对接。对接之后找出对接效果最好或有代表性的物质进行分子动力学模拟。 SYBYL-X1.3软件中Total_Score为总的Surflex-Dock得分，其值愈大说明对接复合物越稳定16。基于选择小分子的原则，本试验中主要考虑以下两点：一是选取对接效果最好的进行模拟；二是从实际状况动身，双酚A普遍存在于自然环境中，而且双酚A类物质含量大大低于BPA，如何去除BPA的危害也将是今后探讨的重点。本试验模拟将选取BPA和另外一种对接效果最好的小分子分别进行分子动力学模拟。 分子动力学模拟：体系模拟在Lin
8、ux系统中的GROMACS17软件上进行。采纳GROMOS96 43A1力场条件，定义晶胞和添加溶剂。模拟系统运用立方体水盒子，蛋白质与水盒子壁的最小距离为1 nm，并且加入了Na+，用以维持系统环境的性质为中性。用最陡下降法进行能量最小化，设置小分子化合物与蛋白质分子为同一整体，并进行系统平衡18。系统平衡包括正则系统NVT平衡和等温等压NPT平衡，两步平衡以保证完全平衡每个系统的性质19。最终，在水环境恒温300 K的系统平衡条件下，对试验进行了10 000步数动力学模拟。 2 结果与分析 2.1 分子对接结果分析 将LiP与双酚A类小分子化合物进行分子对接，得到的分子对接结果如图2所示，
9、其结果数据见表1。由表1可知，BPQ的总值得分最高，说明其与Lip对接最坚固，与LiP的对接稳定性比其他双酚A类化合物好。由于BPA是双酚A类化合物的典型代表，而BPQ与LiP的对接得分最高，对接效果最好，所以选择BPA和BPQ进行模拟分析。 过氧化酶结合位点的结构特性对于其与底物的结合有重要意义。通过SYBYL软件，可以找出小分子化合物与LiP的结合位点，图3中BPQ、BPA活性位点处的氨基酸残基均为HIS39、MET173、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46。在距离LiP活性位点5 ？魡范围内的蛋白质结合位点的氨基酸残基
10、有HIS39、PRO145、 GLU146、PRO147、GLU40、MET173、LEU173、SER174、ALA175、HIS176、ILE42、VAL178、ALA179、ALA180、ARG43、PHE193、ILE235、LEU44、SER237、PHE265、VAL45、PHE269、LEU273、PHE46和HIS47。 氢键在受体和配体的相互结合过程中发挥着重要作用，探讨结合位点上的氨基酸与配体键的距离可以反映受体和配体之间是否发生相互作用。利用SYBYL软件还可以识别氢键连接的位点，即找到并生成氢键的供体和受体。图4显示小分子化合物BPQ、BPA通过氢键连接的氨基酸残基位点
11、和小分子在酶腔体中的位置。从计算结果得知，当BPQ与LiP进行对接时，氢键与酶的3个氨基酸残基相连，它们分别是PRO83.O、ASP183.OD2和ASN182.HD21；当BPA与LiP进行对接时，氢键与酶的2个氨基酸残基相连，分别是PRO83.O和ARG43.HH21。将二者进行比较可知，BPQ、BPA与LiP对接之间的氢键有一个共同的受体，那就是氨基酸残基PRO83.O，说明该氨基酸残基在双酚A类化合物与LiP的反应过程中起着重要作用。在BPQ、BPA与LiP对接的过程中，不仅存在着氢键的作用，而且还存在着疏水力的作用。LiP活性位点旁边亲水面和疏水面如图5所示。LiP活性位点旁边的亲水
12、面和疏水面分别作为氢的受体和供体的两个原子，假如二者在3.5 ？魡距离范围内，则可能存在亲水作用，假如蛋白质中的某个疏水集团抑制剂分子在6.5 ？魡距离内，则二者之间可能存在某种疏水相互作用。由表2中的作用原子键长可知，BPA和BPQ分别在蛋白质活性位点的空腔内形成亲水相互作用。 2.2 动力学模拟结果分析 分子动力学模拟是在水环境中完成，体系的温度为300 K，压力为1.018个大气压20。温度、压力及势能均达到收敛，说明分子动力学模拟正常。模拟过程中将配位蛋白质相对于初始结构的均方根偏差RMSDs值作为衡量体系是否稳定的指标，即检查能量项的收敛状况21。在本试验中蛋白质复合物相对于初始结构
13、的均方根偏差如图6所示。在10 000 ps的分子动力学模拟过程中，小分子BPA和BPQ对蛋白质的影响不同，未结合任何小分子的蛋白质在3 000 ps后基本趋于稳定，而结合了BPA的蛋白质复合体的RMSDs值波动明显，且在8 000 ps时呈上升趋势，这说明小分子BPA的结合增加了蛋白质柔性，而结合了BPQ的蛋白质复合体RMSDs表现与未配位蛋白RMSDs一样，说明白BPQ与酶结合更稳定，BPA比BPQ对LiP酶构象的诱导更显著。 酶和底物结合以后，不仅LiP的构象会变更，小分子的构象也会发生改变，这种改变使得底物更接近于过渡态，可以降低活化能。除了分析蛋白质结构的改变外，本试验同时分析了小分
14、子配体BPQ、BPA在分子动力学模拟过程中结构的改变。图7为小分子配体相对于初始结构的均方根偏差。BPQ的RMSDs值在03 000 ps时波动明显，3 000 ps之后则在0.275 nm四周稳定波动，说明BPQ在结合位点旁边经验构象的变更；而BPA的RMSDs值在3 0008 000 ps起伏改变较大，说明在酶催化反应中底物BPA经验了较多的构象选择；通过对比两种小分子配体RMSDs值可知，BPA比BPQ的上下波动更明显，说明BPA不简单与LiP形成稳定结构，在酶空腔中较难找寻到最适构象。 回旋半径用于度量结构的紧密度，其未配位蛋白质骨架碳原子及其配位后蛋白碳骨架回旋半径22如图8所示。B
15、PQ体系和BPA体系的Rg不同程度变大，说明体系发生了膨胀。其中两个系统的Rg值改变趋势基本是相同的，说明未配位蛋白质、蛋白质与BPQ结合的复合物构象变更的影响是适度的；但是可以明显看出，酶在配位后，BPA的蛋白质的回旋半径改变范围比BPQ的大，证明BPQ对酶的结合更稳定，简单形成过渡态从而加快酶对BPA催化，而BPA对LiP有更多诱导。 三次蛋白质骨架碳原子的基于残基分析的均方根波动23分析如图9显示。由图9可以看出，无配体和有配体的复合物结构对部分残基的柔性的变更是一样。结果表明，蛋白质与小分子反应时氨基酸残基柔性发生变更，即小分子与氨基酸残基发生碰撞位点的改变。 BPA和BPQ经过10
16、000 ps的分子动力学模拟后，在6.5 ？魡之内与蛋白活性位点的相互作用力主要是疏水作用，其状况如图10所示。由图10可以看出，6.5 ？魡距离内，BPQ与活性位点Val184、Glu146、His82、Ile85、Phe193、Arg43、Glu40、His39、Ala180、Asp183、Asn182、Val181、Pro145、Pro83、Pro147、His47总共16个氨基酸残基存在疏水作用；同样，BPA与Met173、Leu169、Val158、Glu146、His176、Ile154、Ile235、Ser237、Pre145、Pre147、His47、Leu173、Phe46共
17、13个氨基酸残基也存在疏水作用。双酚A类小分子与LiP之间的非键相互作用有利于底物的代谢。 3 小结 通过分子对接和分子动力学模拟进行LiP与BPQ、BPA的相互作用探讨，结果表明LiP催化降解BPAs的反应能够自发进行，小分子与酶之间通过氢键连接，BPQ、BPA与LiP的结合位点处的氨基酸残基为HIS39、MET173、ALA175、HIS176、ILE42、ALA179、PHE193、ARG43、ILE235和PHE46。对接时小分子在蛋白质空腔内是亲水性质且呈现弯曲结构，在10 000 ps的分子动力学模拟过程后，BPQ和BPA在LiP活性位点疏水力发挥极大作用。由此可见，双酚A类化合物
18、中疏水作用激活了LiP。另一方面，BPQ和BPA经验了较大的结构改变，底物分子BPA的结构改变更为明显，BPA引起的LiP结构的改变也比BPQ要大，可以看出LiP可能被小分子BPA的诱导比BPQ显著，并在此基础上蛋白质发挥了更进一步的催化代谢作用。因此，推想LiP与BPQ的结合实力比BPA强，但是BPA分子结构以及酶体积和形态的改变程度更大，BPA比BPQ在酶活性中心也会经验更多的催化代谢途径。 参考文献： 1 EUN J K，DONGHO L，BONG C C，et al. Association between urinary levels of bisphenol-A and estro
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