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1、数字PCR技术及其应用 【摘要】数字PCR是继第一代、其次代PCR技术之后，快速发展起来的一种核酸肯定定量技术。在大量反应室中独立扩增单分子核酸，采集产生的荧光信号，通过计算得到检测结果。在病原微生物检测、产前诊断以及癌基因诊断等领域发挥着重要作用。本文对数字PCR的原理、分类以及应用方面进行了综述。 【关键词】数字PCR；医学检验；分类；应用 【中图分类号】Q503 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2022.06.17.02 11015年K.Mullis独创的聚合酶链式反应技术，可以在体外模拟体内核酸的合成过程，大大缩短了试验周期、降低科研成本，是生命科学领域的一
2、项革命性壮举。但传统的PCR技术也有弊端，仅能进行半定量测定，在分析产物时须要进行开盖操作，简单产生假阳性1。随着科学技术的发展，能够实时定量检测核酸的实时荧光定量PCR技术、数字PCR技术也相继出现，一举攻克传统PCR的技术难题。而数字PCR凭借其高通量、高精确度的特点，有着极为广泛的应用前景2。 1 数字PCR技术的原理 数字PCR技术包括两部分，PCR扩增以及荧光信号分析。它的原理是将含有DNA模板的反应体系稀释分别成单分子，安排到大量的反应单元中进行PCR扩增反应，采集每个反应单元的荧光信号，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0。通过阳性微滴的比例或泊松分布公式计算样本的原始浓度或拷贝数
3、，最终获得结果3。 2 数字PCR技术分类 数字PCR的灵敏度取决于检测器的灵敏度、PCR扩增效率以及反应单元的数目。依据反应单元形成的不同方式，将PCR技术分为三类系统： 2.1 微反应室数字 PCR是在不锈钢芯上刻蚀了数以千计的微反应室，同时也将每个反应单元的体积从微升级降至纳升级，提高了样品同量，但须要借助高通量的自动点样仪，提高了仪器成本和操作困难性4。 2.2 微流控芯片数字 PCR是建立在微流体技术、纳米制造技术和微电子技术等发展之上的，它的出现为我们供应了一个实现低成本、小体积和高通量PCR分析的志向平台5。 2.3 液滴数字 PCR系统是在扩增之前进行微滴化处理，以极低的浓度包
4、袱于油水两项形成的数万个纳升至皮升级液滴中，每个液滴都是一个独立的反应体系，扩增后的产物富集在磁性微球上，破乳后收集进行测序6。该技术的优势在于，能够把不同模板的DNA分隔在不同的乳液中，避开了引物与引物之间、不同产物之间的相互影响7。同时可以在不同的反应室中进行同时扩增，实现了高通量测定。 3 数字PCR技术应用 3.1 病原微生物的检测 目前医院主要通过qPCR对血液、脑脊液等临床样本进行病原微生物的检测，但qPCR仍存在较多缺点：不同试验室标准品或者比照品之间存在误差，导致试验室内或者不同试验室之间qPCR的检测结果有差异，需建立统一标准曲线2 ；Yan8等实行感染H7N9的患者十个不同
5、治疗时期的样本，分别进行qPCR及dPCR检测，发觉对于qPCR阴性的样本，dPCR仍可以检测出病毒的存在，说明dPCR的灵敏度远高于qPCR。数字PCR不仅可以对病原体定性，而且还能对病原体DNA或RNA序列进行肯定定量，从而对疾病进行早期诊断、药物疗效视察、病情推断及预后视察，目前数字PCR技术已广泛的应用于HBV、HIV、甲型流感病毒等临床领域9。 3.2 肿瘤诊断 很多肿瘤早期就出现癌基因的突变和表达异样，dPCR技术不仅能有效地检测到癌基因的突变，而且可以精确定量其表达。如肺癌表皮生长因子受体、神经胶质瘤异柠檬酸脱氢酶及葡萄膜黑色素瘤突变的检测9。miRNA是一类由内源基因编码的长度
6、约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它們在动植物中参加转录后基因表达调控，其与癌症也亲密相关10。田辉等人11建立了一种基于连接反应的微滴式数字PCR检测单细胞中miRNA，这与探讨与miRNA有关的疾病有着重要的意义。 3.3 产前诊断 产前诊断可以在诞生前对胎儿的发育状态、患有的疾病等方面进行检测。传统的侵入方法如羊水穿刺和绒毛取样，存在让孕妇流产的风险10。19101年，LO12发觉了存在于孕妇外周血的胎儿游离的cffDN A，为无创产前诊断供应了新的思路。2022年，LO13利用数字PCR进行了cffDNA的异样分析，用于21三体综合征的诊断，上述方法可检测血液中25%的胎儿基因。
7、Barrett14利用cffDNA进行了镰状红细胞贫血的检测。 dPCR作为一项新的技术，还存在很多问题须要解决和探讨。信任随着科技的进步与技术的革新，该技术定将广泛的应用在生命科学的各个领域。 参考文献 1赵焕英，包金风.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用探讨进展J.中国组织化学与细胞化学杂志，2022：492-4101. 2胡思宏，鲍登克，万绍贵.数字PCR及其在现代医学分子诊断中的应用J.中国生物化学与分子生物学报，2022，33：861-866. 3李春勇.数字PCR技术原理及应用J.生物技术世界，2022：10-13. 4林彩琴，姚 波.数字PCR技术进展J.化学进展，2022，2
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