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1、第六章 PCRPCR技术及其应用技术及其应用1 PCR技术原理2 PCR技术应用烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第一节 PCR技术原理烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人一、PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶 解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮
2、肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGA
3、CGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明19711971年年，KhoranaKhorana提提出出：经经过过DNADNA变变性性，与与合合适适引引物物杂杂交交，用用DNADNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并不断重复该过程便可克隆并不断重复该过程便可克隆tRNAtRNA基因。
4、基因。但但由由于于测测序序和和引引物物合合成成的的困困难难，以以及及7070年年代代基基因因工工程程技技术术的的发发明明使使克克隆隆基基因因成成为为可可能能，所所以以，KhoranaKhorana的的设设想想被被人人们们遗遗忘了忘了烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR技术简史DNA的复制聚合酶链反应的发明19851985年年，美美国国PE-CetusPE-Cetus公公司司的的MullisMullis等等人人发发明明了了聚聚合合酶酶链反应（链反应（PCRPCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理
5、是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制最最初初采采用用E-coli E-coli DNADNA聚聚合合酶酶进进行行PCRPCR，由由于于该该酶酶不不耐耐热热，使这一过程耗时，费力，且易出错使这一过程耗时，费力，且易出错耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶的的应应用用使使得得PCRPCR能能高高效效率率的的进进行行，随随后后PE-CetusPE-Cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCRPCR自动化热循环仪自动化热循环仪19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病
6、人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Kary B.Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何
7、来治疗该病人7272949494945555PCRPCR循环循环循环循环烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人二、PCR的基本原理类似于类似于DNADNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNADNA模板模板加热加热变性变性解链，随之将反应混合物冷却至某解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生生退火退火，再将温度升高使退火引物在，再将温度升高使退火引物在DNADNA聚合聚合酶作用下得以酶作用下得以延伸延伸。这种热变性这种热变性-复
8、性复性-延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCRPCR循环，循环，PCRPCR就是在合适条就是在合适条件下的这种循环的不断重复。件下的这种循环的不断重复。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR Cycle-Step 1PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template -Denaturation Template DNA by Heat(95DNA
9、by Heat(95o oC)C)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；以便它与引物结合，为下轮反应作准备；烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR Cycle-Step 2 PCR Cycle-Step 2 Te
10、mperature is lowered(TTemperature is lowered(Tm m)and primers anneal to)and primers anneal to target sequencestarget sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温经加热变性成单链后，温度降至度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；烧伤病人的治疗通常是取烧伤
11、病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR Cycle-Step 3-PCR Cycle-Step 3-At 72 At 72 o o C C TaqTaq DNA polymerase catalyses primer DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are extension as complementary nucleotides are incorporatedincorporatedTarget Sequence
12、Target SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTP为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理，合成一条新的与模板条新的与模板DNA 链。链。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人End of the 1st PCR Cycle End of the 1st P
13、CR Cycle Results in two copies of target sequenceResults in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一个每完成一个循环需循环需24分钟，分钟，23小时就能将小时就能将待扩目的基待扩目的基因扩增放大因扩增放大几百万倍。几百万倍。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Target AmplificationTarget AmplificationNo.ofNo.Ampl
14、icon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人三、PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应条件：10
15、X10X缓冲液缓冲液 10 10 L L4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12 2 g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+2+1.5mmol/L1.5mmol/L烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR仪烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR反应
16、PCR反应条件PCR过程PCR的特点烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人模板DNA95烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移
17、植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点50引物1引物2DNA引物烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该
18、病人PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点72第1轮结束第2轮开始烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点955072TaqTaqTaqTaq烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程
19、过程PCRPCR的特点的特点72第2轮结束烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面
20、积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ugug=10=10-6-6)水平水平2.2.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产
21、物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提的粗提DNADNA烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。四、PCR反应体系烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请
22、同学们想一想如何来治疗该病人（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。烧伤病人的
23、治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人2）循环参数(1)变性 (2)使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒(2)退火
24、温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（3）延伸 70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人五、五、PCRPCR引物的设计一般原则引物的设计一般原则引引引引物物物物长长长长度度度度一一一
25、一般般般般以以以以181830bp30bp为为为为宜宜宜宜，过过过过短短短短则则则则降降降降低低低低特特特特异异异异性性性性，过过过过长长长长则则则则会会会会引引引引起起起起引引引引物物物物间间间间的的的的退退退退火火火火而而而而影影影影响响响响有有有有效效效效扩扩扩扩增增增增，同同同同时时时时也增加引物合成的成本也增加引物合成的成本也增加引物合成的成本也增加引物合成的成本。避避避避免免免免引引引引物物物物内内内内部部部部出出出出现现现现二二二二级级级级结结结结构构构构，避避避避免免免免序序序序列列列列内内内内有有有有较较较较长长长长的的的的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。回文结构，使引
26、物自身不能形成发夹结构。回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/CG/C和和和和A/TA/T碱碱碱碱基基基基均均均均匀匀匀匀分分分分布布布布，G+CG+C含含含含量量量量在在在在404060%60%之之之之间间间间，引引引引物物物物碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列尽尽尽尽可可可可能能能能选选选选择择择择碱碱碱碱基基基基随随随随机机机机分分分分布布布布，避避避避免免免免出现嘌呤或嘧啶连续排列出现嘌呤或嘧啶连续排列出现嘌呤或嘧啶连续排列出现嘌呤或嘧啶连续排列。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同
27、学们想一想如何来治疗该病人要要要要避避避避免免免免两两两两个个个个引引引引物物物物间间间间特特特特别别别别是是是是33末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列互互互互补补补补以以以以及及及及同同同同一一一一引引引引物物物物自自自自身身身身33末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列互互互互补补补补的的的的，使使使使它它它它们们们们不不不不能能能能形成引物二聚体或发卡结构形成引物二聚体或发卡结构形成引物二聚体或发卡结构形成引物二聚体或发卡结构。引引引引物物物物33末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基一一一一般般般般应应应应与与与与模模模模板板板板DNADNA严严严严格格格格配配配配对
28、对对对，并并并并且且且且33末端为末端为末端为末端为GG、C C或或或或T T时引发效率较高时引发效率较高时引发效率较高时引发效率较高。引引引引物物物物55末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基可可可可不不不不与与与与模模模模板板板板DNADNA匹匹匹匹配配配配，可可可可添添添添加加加加与与与与模模模模板板板板无无无无关关关关的的的的序序序序列列列列(如如如如限限限限制制制制性性性性核核核核酸酸酸酸内内内内切切切切酶酶酶酶的的的的识识识识别别别别序序序序列列列列、ATGATG起起起起始始始始密密密密码码码码子子子子或或或或启启启启动动动动子子子子序序序序列列列列等等等等)，便便便便于于于于克克克克隆
29、隆隆隆和和和和表表表表达，但其保护碱基有一定的要求达，但其保护碱基有一定的要求达，但其保护碱基有一定的要求达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人六、PCR中应注意的事项（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EPEP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对
30、照二）设立对照：阳性对照：阳性对照：阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照：阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照：除模板外的所有组分除模板外的所有组分烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节 PCR技术应用烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人一、PCR技术的主要类型反向反向PCR PCR 锚定锚定PCRPCR不对称不对称PCR PCR 原位原位PCRPCRRT-PCR RT-PCR 重组重组PCRPCR差异显示差异显示P
31、CRPCR免疫免疫PCRPCR实时定量实时定量PCRPCR多重多重PCRPCR烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人1)反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人
32、来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人2）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积
33、烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 高浓度引物低浓度引物烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人3 3）RTRTPCR:PCR:是以反转录的是以反转录的cDNAcDNA作模板所进行作模板所进行的的PCRPCR反应反应,用于测定基因表达的强度和鉴定用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变已转录序列是否发生突变,呈现呈现mRNAmRNA多态性多态性,克隆克隆mRNAmRNA的的55和和33末端序列末端序列,以及从非常少以及从非常少量的量的mRNAmRNA样品构建大容量的样品构建
34、大容量的cDNAcDNA文库。文库。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人4 4）多重）多重PCRPCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的：在
35、一个反应体系中使用一对以上引物的PCRPCR称为多重称为多重PCRPCR。其结果是产生多个。其结果是产生多个PCRPCR产物，用于检产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人5 5）实时定量）实时定量PCRPCR技术原理技术原理实时定量实时定量PCRPCR（也称（也称TaqMan PCR,TaqMan PCR,以下简称以下简称FQ-PCRFQ-PCR）是美国）是美国PEPE（Perkin ElmerPerkin Elme
36、r）公司）公司19951995年研制出来的一种新的核酸定量技术，年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规该技术是在常规PCRPCR基础上加入荧光标记探针基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通来实现其定量功能的，与变通PCRPCR相比，相比，FQ-FQ-PCRPCR具有许多优点。具有许多优点。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人实时定量实时定量PCR(real-time PCR):PCR(real-time PCR):通过特定设计的通过特定设计的PCRPCR仪器来实时检测仪器来实时检测PC
37、RPCR扩增扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量实时定量PCRPCR。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人实时荧光定量实时荧光定量PCR:PCR:实时定量实时定量PCRPCR在检测过程中通过检测标记的荧在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个光信号的累积来实时监测整个PCRPCR进程，最后进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故通过标准曲线对未知模板进行定量
38、分析，故称为实时荧光定量称为实时荧光定量PCRPCR。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人原理和方法FQ-PCRFQ-PCR的工作原理是的工作原理是利用利用TaqTaq酶的酶的5353外切酶活性，在外切酶活性，在PCRPCR反反应系统中加入一个荧光标记探针应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的。该探针可与引物包含序列内的DNADNA模板发生特异性杂交，模板发生特异性杂交，探针的探针的55端标以荧光发射基因端标以荧光发射基因FAMFAM（荧光发（荧光发射峰值在射峰值在518nm518nm处
39、），处），靠近靠近33端标以荧光淬灭基团端标以荧光淬灭基团TAMRATAMRA（荧光发射（荧光发射峰值在峰值在582nm582nm处），探针的处），探针的33端被磷酸化以防止探针在端被磷酸化以防止探针在PCRPCR扩增过程中被延伸。当扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm518nm处的光密度增加而被荧光探测系处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板统检测到。复性期探针与模板DNADNA发生杂交，延伸
40、期发生杂交，延伸期TaqTaq酶酶随引物延伸沿随引物延伸沿DNADNA模板模板移动，移动，当移动到探针切断当移动到探针切断,淬灭作用被解除淬灭作用被解除，荧光信号释放出来，荧光信号释放出来.模模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放被释放的荧光基团数目和的荧光基团数目和PCRPCR产物数量是一对一的关系产物数量是一对一的关系,因此用该技术因此用该技术可对模板进行准确定量。可对模板进行准确定量。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如
41、何来治疗该病人烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 实时实时PCRPCR技术原理技术原理实验仪器一般使用实验仪器一般使用PEPE公司研制的公司研制的ABI7100ABI7100型型 PCRPCR扩增仪，也可用其它扩增仪，也可用其它PCRPCR仪。如果用仪。如果用ABI7700ABI7700型反应型反应系统进行实验，反应结型反应型反应系统进行实验，反应结束后束后,通过电脑分析通过电脑分析,可直接给出定量结果。如可直接给出定量结果。如果用其他果用其他PCRPCR仪仪,则需要同时使用荧光探测仪测则需要同时使用荧
42、光探测仪测量反应管中的荧光信号量反应管中的荧光信号,计算出计算出RQ+RQ+、RQ-RQ-、RQRQ。RQ+RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率与淬灭基团发光强度的比率,RQ-,RQ-代表空白管中代表空白管中二者的比率二者的比率,RQ,RQ（RQ=RQ+-RQ-RQ=RQ+-RQ-）代表）代表PCRPCR过过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果。出定量结果。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 由于
43、荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。探针设计一般应符合以下条件：针设计一般应符合以下条件：探针长度应在探针长度应在20204040个碱基左右，保证结合特异性。个碱基左右，保证结合特异性。GCGC碱基含量在碱基含量在40%40%60%60%，避免单核苷酸序列的重复。，避免单核苷酸序列的重复。避免与引物发生杂交或重叠。避免与引物发生杂交或重叠。探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的定程度，因此探针的TmTm值要比引物的值要比引物的TmTm值至少高出值至少高出55。另外，探针的浓
44、度、探针与模板序列的同源性，探针与另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。引物的距离都对实验结果有影响。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 特特 点点FQ-PCRFQ-PCR不仅具有普通不仅具有普通PCRPCR的的高灵敏性高灵敏性，而且由于荧，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCRPCR扩增扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNADNA杂交的高
45、特异性和光谱技术的高精确性杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克，克服了常规服了常规PCRPCR的许多缺点。的许多缺点。FQ-PCRFQ-PCR只须在加样时打开一次只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCRPCR后处理，后处理，避免了常规避免了常规PCRPCR操作中的诸多弊端。操作中的诸多弊端。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 1 病原体测定由于由于PCRPCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但技术的问世，使得病原体检测能够快
46、速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，有微量病原体存在，PCRPCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规板定量显得特别重要。常规PCRPCR由于不能定量而限制了其应用，然由于不能定量而限制了其应用，然而，而，PEPE公司研制的公司研制的FQ-PCRFQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前技术给解决这一问题提供了
47、可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。MorrisMorris等用等用FQ-PCRFQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（者血清中丙肝病毒（HCVHCV）进行了研究。）进行了研究。FQ-PCRFQ-PCR技术在保持巢式技术在保持巢式PCRPCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCVHCV的的有效方法。同时，由于有
48、效方法。同时，由于FQ-PCRFQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。给药物治疗及疗效观察提供参考依据。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大量的量的PCRPCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国WithamWitham等等19961996年将年将FQ-PCRFQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志技术应
49、用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性。由于以提高实验的准确性和精确性。由于TaqManTaqMan系统可以一系统可以一次测量次测量9696管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要管样品，还可对模板进行准
50、确定量，又不需要进行电泳及进行电泳及EBEB染色后处理过程，实际应用方便，从而提染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。品检测方面的一个突破。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 2.肿瘤研究意大利意大利GelminiGelmini等用等用FQ-PCRFQ-PCR技术检测乳腺癌标本技术检测乳腺癌标本c-erbB-2c-erbB-2基因拷贝基因拷贝数目变异情况。他们以数目变异情况。他们以-肌动蛋