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1、 课题课题3 酵母细胞的固定化酵母细胞的固定化1 一、基础知识一、基础知识1 1、酶制剂的概念和种类、酶制剂的概念和种类（一）酶制剂（一）酶制剂含有酶的制品含有酶的制品定义：定义：多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶多酶片、加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶和脂肪酶种类：种类：A A、液体酶制剂、液体酶制剂治疗某些胃病的胃蛋白酶液治疗某些胃病的胃蛋白酶液B B、固体酶制剂、固体酶制剂2 2 2、酶的生产、酶的生产提取法提取法定义：定义：采用一定的技术直接从动植物或微生采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将酶提取出来物的组织、细胞中将酶提取出来优点：优点：简单易行，在动植物或微生物资源简单易行，在
2、动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值丰富的地区具有应用价值实例：在屠宰厂，可以从家畜胰脏中提取出实例：在屠宰厂，可以从家畜胰脏中提取出胰酶；在水果加工厂，可以从菠萝皮中提取胰酶；在水果加工厂，可以从菠萝皮中提取出菠萝蛋白酶出菠萝蛋白酶缺点：缺点：要有充足的原材料，广泛应用受到要有充足的原材料，广泛应用受到限制限制3 发酵法发酵法定义：定义：通过微生物发酵获得所需要的酶通过微生物发酵获得所需要的酶如果是胞外酶，可以从发酵液中直如果是胞外酶，可以从发酵液中直接提取；如果是细胞内酶，则可将接提取；如果是细胞内酶，则可将细胞弄碎再经过提取纯化而得到细胞弄碎再经过提取纯化而得到易培养、繁殖速度快、便
3、于大规易培养、繁殖速度快、便于大规模生产模生产优点：优点：提取方式：提取方式：4 化学合成法化学合成法缺点：缺点：成本高、已知分子结构的酶成本高、已知分子结构的酶提取出来的酶还要经过提取出来的酶还要经过分离、纯化分离、纯化，再加入适，再加入适量的量的稳定剂和填充剂，稳定剂和填充剂，制成相应的制成相应的酶制剂酶制剂后才后才能用于催化化学反应能用于催化化学反应3 3、酶的提取和分离纯化、酶的提取和分离纯化5 n正品beely奇七效合一bb霜50g完美裸妆保湿遮瑕n购买地址nhttp:/ 酶的提取酶的提取盐溶液提取法、碱溶液提取法、有机盐溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法溶剂提取法适宜的温度和
4、适宜的温度和pHpH和保护剂和保护剂方法：方法：条件：条件：酶的分离提纯酶的分离提纯沉淀技术（密度梯度离心法）沉淀技术（密度梯度离心法）层析技术层析技术方法：方法：7 4 4、酶制剂特点酶制剂特点(看课本看课本P49P49面）面）天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活剂等条件非常敏感，容易失活溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本了生产成本反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用难以在工业生产中广泛应用（1 1）优点）优点（2 2）
5、实际问题）实际问题催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域品、化工等各个领域品、化工等各个领域品、化工等各个领域如何解决如何解决这些问题这些问题？8 （二）固定化酶（二）固定化酶固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂又能发挥催化
6、作用的酶制剂（三）固定化细胞（三）固定化细胞将细胞限制或定位于特定空间位将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术置的方法称为细胞固定化技术被限制或定位于特定空间位置被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞的细胞称为固定化细胞固定化技术：固定化技术：固定化细胞：固定化细胞：9 类型类型类型类型优点优点优点优点不足不足不足不足直接直接直接直接使用使用使用使用酶酶酶酶催化效率高，低耗能、催化效率高，低耗能、催化效率高，低耗能、催化效率高，低耗能、低污染等低污染等低污染等低污染等对环境条件非常敏感，容易失活；对环境条件非常敏感，容易失活；对环境条件非常敏感，容易失活；对环境条件非常
7、敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再溶液中的酶很难回收，不能被再溶液中的酶很难回收，不能被再溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应次利用，提高了生产成本；反应次利用，提高了生产成本；反应次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产后酶会混在产物中，可能影响产后酶会混在产物中，可能影响产后酶会混在产物中，可能影响产品质量品质量品质量品质量固定固定固定固定化酶化酶化酶化酶酶既能与反应物接触，酶既能与反应物接触，酶既能与反应物接触，酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同又能与产物分离，同又能与产物分离，同又能与产物分离，同时，固定在载体上的时，固定在载体上的时，
8、固定在载体上的时，固定在载体上的酶还可以被反复利用酶还可以被反复利用酶还可以被反复利用酶还可以被反复利用一种酶只能催化一种化学反应，一种酶只能催化一种化学反应，一种酶只能催化一种化学反应，一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形而在生产实践中，很多产物的形而在生产实践中，很多产物的形而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能成都通过一系列的酶促反应才能成都通过一系列的酶促反应才能成都通过一系列的酶促反应才能得到的得到的得到的得到的固定固定固定固定化细化细化细化细胞胞胞胞成本低、操作容易、成本低、操作容易、成本低、操作容易、成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、对酶
9、活性的影响更小、对酶活性的影响更小、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反可以催化一系列的反可以催化一系列的反可以催化一系列的反应、容易回收应、容易回收应、容易回收应、容易回收固定后的酶或细胞与反应物不容固定后的酶或细胞与反应物不容固定后的酶或细胞与反应物不容固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降易接近，可能导致反应效果下降易接近，可能导致反应效果下降易接近，可能导致反应效果下降由于大分子物质难以自由通过细由于大分子物质难以自由通过细由于大分子物质难以自由通过细由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也胞膜，因此固定化细胞的应用也胞膜，因此固定化细胞的应用也胞膜
10、，因此固定化细胞的应用也受到限制受到限制受到限制受到限制（四）（四）（四）（四）直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点10 （五）（五）酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法(看课本看课本P P5050面）面）思考：固定化酶或固定化细胞可以采取哪些方法？思考：固定化酶或固定化细胞可以采取哪些方法？思考：固定化酶或固定化细胞可以采取哪些方法？思考：固定化酶或固定化细胞可以采取哪些方法？各有什么利弊？各有什么利弊？各有什么利弊？各有什么利弊？1 1、物理吸附法、物
11、理吸附法2 2、包埋法、包埋法3 3、化学结合法、化学结合法11 12 13 14 （六）酶和细胞固定方法的选择（六）酶和细胞固定方法的选择酶适合采用化学结合和物理吸附法固定酶适合采用化学结合和物理吸附法固定细胞适合采用包埋法固定细胞适合采用包埋法固定1 1、方法、方法2 2、原因、原因细胞个大，酶分子很小细胞个大，酶分子很小个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出酶容易从包埋的材料中漏出15 （七）固定化酶的应用实例（七）固定化酶的应用实例1 1、高果糖浆、高果糖浆生产原料生产原料葡萄糖，葡萄糖是由淀粉转化而来葡萄糖，葡萄糖是由淀粉转化
12、而来是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆合糖糖浆生产机理生产机理16 17 生产流程生产流程含淀粉含淀粉的浆液的浆液-淀粉酶淀粉酶糊精糊精糖化酶糖化酶葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖异构酶异构酶葡萄糖的葡萄糖的异构化异构化42%42%45%45%转化成果糖转化成果糖果葡糖浆果葡糖浆果糖和葡果糖和葡萄糖分离萄糖分离葡萄糖再葡萄糖再次异构化次异构化反复多次反复多次果糖含量果糖含量70%70%90%90%高果糖
13、浆高果糖浆18 生产优点生产优点反应柱能连反应柱能连续使用半年，续使用半年，大大降低了大大降低了生产成本，生产成本，提高了果糖提高了果糖的产量和质的产量和质量量19 二、实验操作二、实验操作（一）方法（一）方法1 1、包埋法固定化细胞、包埋法固定化细胞2 2、海藻酸钠作载体包埋酵母细胞、海藻酸钠作载体包埋酵母细胞（二）制备固定化酵母细胞（二）制备固定化酵母细胞20 1 1、酵母细胞的活化、酵母细胞的活化 过程过程称取称取1g1g干酵母，放入干酵母，放入50ml50ml的小烧杯中，加的小烧杯中，加入蒸馏水入蒸馏水10ml10ml。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞。用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状
14、，放置混合均匀，成糊状，放置1h1h左右，使其活化左右，使其活化注意事项注意事项A A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一物种单一B B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于活化就是让处于()()的微生物重的微生物重新恢复正常的生活状态新恢复正常的生活状态休眠状态休眠状态21 22 2 2、配置物质的量浓度为、配置物质的量浓度为0.05mol/L0.05mol/L的的CaClCaCl2 2溶液溶液 过程过程称取无水称取无水CaClCaCl2 2 0.83g0.83g，放入，放入200ml200ml的烧杯
15、的烧杯中，加入中，加入150ml150ml的蒸馏水，使其充分溶解，的蒸馏水，使其充分溶解，待用待用注意事项注意事项溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果自来水中各种离子影响实验结果23 3 3、配制海藻酸钠溶液、配制海藻酸钠溶液称取称取0.7g0.7g海藻酸钠，放入海藻酸钠，放入50ml50ml小烧杯中，加入小烧杯中，加入10ml10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至至10ml10ml 过程过程注意事项注意
16、事项加热时要用加热时要用()()，或者，或者()()，反，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止复几次，直到海藻酸钠溶化为止小火小火间断加热间断加热24 海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少的数目少25 26 4 4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移以活化的酵
17、母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中至注射器中 过程过程注意事项注意事项A A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌否则会因温度过高杀死酵母菌27 28 B B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察免影响实验结果的观察（5 5）固定化酵母细胞）固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的到配制好的CaClCaCl2 2溶液中，将形成的凝胶珠在溶液中，将形成的凝胶珠在CaClCaCl2 2溶液中浸泡溶液中浸泡30min30
18、min左右左右 过程过程29 30 注意事项注意事项A A、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照珠，用作对照B B、海藻酸钠胶体在、海藻酸钠胶体在CaClCaCl2 2这种电解质的作用这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min30min左右左右（三）用固定化酵母细胞发酵（三）用固定化酵母细胞发酵将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2 23 3次，次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液1 1、过程、过程31 刚形成的凝胶珠应在刚形成的凝胶
19、珠应在CaClCaCl2 2溶液中浸泡一溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二二是是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的成功的32 将将150ml150ml质
20、量分数为质量分数为1010的葡萄糖溶液转移的葡萄糖溶液转移至至200ml200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于胞，置于2525C C下发酵下发酵24h24h2 2、注意事项、注意事项控制好发酵温度，一般是室温控制好发酵温度，一般是室温25 25 C C发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显长一些，效果明显可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果照实验结果33 34 （一）观察凝胶珠的颜色和形状（一）观察凝胶珠的颜色和形状如果制作的如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需，制作失败，需要再作尝试。要再作尝试。（二）观察发酵的葡萄糖溶液（二）观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味到产生了很多气泡，同时会闻到酒味课题成果评价课题成果评价35