《中华绒螯蟹Na~ -K~ -Cl~-协同转运蛋白基因的克隆和功能分析.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中华绒螯蟹Na~ -K~ -Cl~-协同转运蛋白基因的克隆和功能分析.docx（2页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、cDNA 合成：使用 PrimeScript RT reagent Kit ( TaKaRa )将 RNA 转录为cDNAoPCR 扩增:利用 SYBR Premix Ex Taq II Kit ( TaKaRa )进行 PCR反应，反应体系中Na+-K+-CI-协同转运蛋白基因的引物序列是： F:5,-GCGATGTTCAATCTTCTGAG-3,; R:51-GTGGCCTACTACGAAACCAC- 3。PCR 程序:94 5min ; 94 30s , 55 30s , 72 60s ,重复 30 个 周期；72 10mino克隆和序列分析：PCR产物纯化后连接到pMDTMi%T Si
2、mple Vector (TaKaRa )中，并转化到大肠杆菌DH5a进行克隆。对于含有正确插入 序列的克隆子进行测序，并使用BLAST程序进行序列比对和分析。功能分析：通过转染技术，在中华绒螯蟹细胞中过表达目标基因。 利用qRT-PCR技术检测目标基因的表达。将过表达的细胞与对照细胞在 不同盐浓度环境中生长一段时间，观察细胞生长状态并进行染色体观察。结果从中华绒螯蟹体内克隆了一个Na+-K+-CI-协同转运蛋白基因， 序列长度为1109bp。比对结果表明，该基因与其他物种中的Na+- K+-CI-协同转运蛋白基因高度保守。对基因序列进行功能分析，发现 该基因具有促进电解质离子的转运和调节电解
3、质平衡的功能。利用转染 技术将该基因过表达于中华绒螯蟹细胞中，发现该基因能够提高中华绒 螯蟹对高盐环境的适应性，细胞生长状态良好，染色体数量也有所增加。结论本研究成功地克隆了中华绒螯蟹Na+-K+-CI-协同转运蛋白基因, 并揭示了其在电解质平衡调节和高盐适应性方面的重要作用。该研究为 进一步深入研究中华绒螯蟹的电解质平衡调节和高盐适应性机理提供了 基础和参考。参考文献L陶铸,郝磊,卢国俊,等.中华绒螯蟹养殖技术刀,中国水产科学， 2019, 26(3): 110-119.2 .王佳琪,边涛涛，邱清波.Na+-K+-CI-协同转运蛋白基因的研 究进展J.基因组学与应用生物学，2018, 37(6): 1615-1622.3 . Liu Z, Li J, Liu S, et al. Molecular cloning and tissue expression patterns of Na+-K+-CI-cotransporter (NKCC) and Na+-CI- cotransporter (NCC) in swimming crab Portunus trituberculatusJ. Aquaculture, 2020, 523: 735131.