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1、 某种生物某种生物（所有所有或或部分部分DNA)限制酶限制酶多个多个DNA片段片段多个重组多个重组DNA受体菌的不同个体受体菌的不同个体分别导入分别导入DNA连接酶连接酶载体载体群体（群体（基因组基因组或或部分基因文库部分基因文库）（不同个体含不同（不同个体含不同DNA片段）片段）（同种限制酶切割）同种限制酶切割）1.从基因组文库中从基因组文库中提取目的基因提取目的基因目目的的基基因因的的制制备：备：PCRPCR技术技术DNADNA复制复制过程过程DNADNA变性（变性（90909595）退火退火（复性（复性55556060）子链延伸子链延伸（70707575）重复循环重复循环DNADNA复制
2、起始，复制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段生成RNARNA引物水引物水解解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同点点原则原则碱基互补配对碱基互补配对条件条件模板、原料（模板、原料（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）、能量、酶、引物等）、能量、酶、引物等不同不同点点解旋方解旋方式式氢键在高温下断氢键在高温下断裂，双链全部解裂，双链全部解开开解旋酶催化氢键逐步断裂解旋酶催化氢键逐步断裂场所场所体外体外主要在细胞核中主要在细胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋
3、酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶等连接酶等结果结果在短时间内形成在短时间内形成大量的大量的DNADNA片段片段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子2.利利用用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因(1)反转录法：反转录法：以目的基因转录成的以目的基因转录成的信使信使RNARNA为模板，反转录成为模板，反转录成互补的单链互补的单链DNADNA，然后在酶然后在酶的作用下合成双链的作用下合成双链DNADNA，从从而获得所需的基因。而获得所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反
4、转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)3、人工合成目的基因（、人工合成目的基因（DNA合成仪）合成仪）已知核苷酸序列，且基因较小，已知核苷酸序列，且基因较小，也可通过也可通过DNADNA合成仪合成仪用化学方法直用化学方法直接人工合成。接人工合成。(2)根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法法：根据已知蛋白质的氨基根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使酸序列，推测出相应的信使RNARNA序列，然后按照碱基互序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，
5、以过化学方法，以单核苷酸单核苷酸为为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成蛋白质的氨基酸排列顺序可以用测序仪自动完成。蛋白质的氨基酸排列顺序可以用测序仪自动完成。如何构建？如何构建？导入的方法？导入的方法？如何检测？如何检测？进行细胞培养进行细胞培养1.基因工基因工程流程图：程流程图：（重组重组DNADNA分子分子导入导入农杆菌，再让农杆菌农杆菌，再让农杆菌感染感染植物细胞）植物细胞）1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞农杆菌转化
6、法：农杆菌转化法：基因枪法：基因枪法：花粉管通道法花粉管通道法双子叶双子叶+裸子植物裸子植物单子叶单子叶生出生出转基因动物转基因动物基因表达载体基因表达载体显微注射仪显微注射仪注入注入受精卵受精卵早期胚胎早期胚胎移植移植输卵管或子宫中发育输卵管或子宫中发育发育发育大肠杆菌大肠杆菌Ca2+处理处理感受态细胞感受态细胞（易吸收（易吸收DNA的生理状态）的生理状态）基因表达载体基因表达载体缓冲液缓冲液转基因生物转基因生物适宜温度适宜温度混混合合培培养养3.3.目的基因导入目的基因导入 微生物细胞微生物细胞2、目的基因导入动物细胞、目的基因导入动物细胞（常用（常用受精卵受精卵）2.蛋白质工程流程图：蛋
7、白质工程流程图：预期预期功能功能DNA合成合成分子分子设计设计生物生物功能功能转录转录翻译翻译折叠折叠光光下培养下培养愈伤愈伤组织组织胚状体胚状体或丛芽或丛芽植植物物体体脱分化脱分化再分化再分化离体离体的植物的植物组织或细胞组织或细胞发育发育避光避光培养培养1、植物组织培养技术、植物组织培养技术注意技术的原理、培养的条件、特点、注意技术的原理、培养的条件、特点、优点。优点。营养、营养、激素激素营养、营养、激素激素杂杂种种植植株株融合的融合的原生质原生质体体ABAB再再生生出出细细胞胞壁壁脱脱分分化化愈愈伤伤组组织织再再分分化化2.植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术1.植物细胞的融合植物细胞的
8、融合2.植物组织培养植物组织培养植物细胞植物细胞A原生质体原生质体B原生质体原生质体A杂种杂种细胞细胞AB去去 壁壁人人工工诱诱导导融合融合完成完成的的标志标志植物细胞植物细胞B去壁去壁-酶解法酶解法融合内容：膜、质、核的融合。融合内容：膜、质、核的融合。物理法物理法化学法化学法（筛选（筛选出杂种出杂种细胞）细胞）融合原理：膜的流动性；融合原理：膜的流动性；动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白胰蛋白酶处理酶处理剪刀剪刀剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培加培养液养液制成制成细胞细胞悬浮悬浮液液不死细胞不死细胞原理：细胞增值原理：细胞增值无限传代无限传代作用：去作用：去掉组
9、织间掉组织间蛋白质蛋白质思考思考:动物细胞动物细胞培养最终能培养培养最终能培养成生物体成生物体?1.动物细胞培养培养过程：动物细胞培养培养过程：不能不能部分细胞部分细胞遗传物质遗传物质改变改变原代培养原代培养随细胞数增多，细胞分裂随细胞数增多，细胞分裂贴壁生长贴壁生长到表面相互接触时就会停止分裂增到表面相互接触时就会停止分裂增殖殖细胞细胞接触抑制接触抑制传代培养传代培养动物细胞培养条件动物细胞培养条件1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境:（添加一定量的抗生素，定期更换培养液（添加一定量的抗生素，定期更换培养液.）2、营养、营养:（葡萄糖、氨基酸、葡萄糖、氨基酸、促生长因子促生长因子、无机盐、
10、维生素、动无机盐、维生素、动物血清等。）物血清等。）3、温度和、温度和PH:36.5+（-）0.5度度,7.2-7.44、气体环境（注意作用、气体环境（注意作用）O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）O2是细胞代谢的需要，是细胞代谢的需要，CO2是维持培养液的是维持培养液的PH值值某种生物某种生物（供体）（供体）M期的期的卵母细胞卵母细胞体细胞体细胞细胞质细胞质细胞核细胞核早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂重组细胞重组细胞体细胞核移植体细胞核移植细胞培养细胞培养受体受体（代孕）母体子宫（代孕）母体子宫胚胎移植胚胎移植与供体生物遗传物质相同的个体与供体生物遗传物质相同的个体分娩分娩妊娠妊娠2.克隆
11、动物产生的过程：克隆动物产生的过程：不同不同DNA的两个细的两个细胞胞A和和B灭火的病毒等灭火的病毒等融合的细胞融合的细胞（两个核）（两个核）杂交细胞杂交细胞（单个核）（单个核）有丝分裂有丝分裂3.动物细胞融合动物细胞融合杂交细胞的特点是什么？杂交细胞的特点是什么？杂交杂交杂交杂交细胞细胞细胞细胞灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞经免疫经免疫经免疫经免疫的小鼠的小鼠的小鼠的小鼠提取提取杂交瘤杂交瘤杂交瘤杂交瘤细胞细胞细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选用特定的
12、用特定的选选择性培养基择性培养基第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二次筛选能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体克隆化培养克隆化培养和抗体检测和抗体检测4.单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备比比较项较项目目植物植物组织组织培养培养动动物物细细胞培养胞培养原理原理细细胞的全能性胞的全能性细细胞增殖胞增殖培养
13、基性培养基性质质固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动动物血清物血清培养培养结结果果植物体植物体细细胞株、胞株、细细胞系胞系培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获获得得细细胞或胞或细细胞胞分泌蛋白分泌蛋白1、植物组织培养与动物细胞培养的比较、植物组织培养与动物细胞培养的比较2、植物体细胞杂交与动物细胞融合的区别、植物体细胞杂交与动物细胞融合的区别主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种获得杂种植株植株用用 途途物理、化学方物理、化学方法法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心
14、、物理（离心、振振荡、电刺激）荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后使细胞分散后诱诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合细胞融合的过程的过程细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性细胞融合细胞融合的原理的原理动物细动物细胞融合胞融合植物体细胞植物体细胞杂交杂交比较项目比较项目 精子、卵子发生的比较精子、卵子发生的比较 项项目目精子精子发发生生卵子卵子发发生生区区别别场场所所睾丸的曲睾丸的曲细细精管（唯精管（唯一一场场所）所）卵巢（卵巢（MIMI）、）、输输卵管（卵管
15、（MIIMII）（场场所不唯一）所不唯一）时时 间间初情期开始到生殖机初情期开始到生殖机能衰退能衰退性性别别分化后开始，卵泡的形成和在卵分化后开始，卵泡的形成和在卵巢内的巢内的储备储备，是在出生前（胎儿期），是在出生前（胎儿期）完成的，减数第二次分裂是在精子和完成的，减数第二次分裂是在精子和卵子的卵子的结结合合过过程中（受精程中（受精过过程）完成程）完成的的过过程程特点特点1.MI1.MI和和MIIMII是是连续连续的，的，需需变变形形2.2.细细胞胞质质均等分配均等分配1 1、MIMI和和MIIMII是不是不连续连续的，不需的，不需变变形形2 2、细细胞胞质质不均等分配不均等分配结结果果形成
16、形成4 4个精个精细细胞胞形成形成1 1个卵个卵细细胞和胞和3 3个极体（极体将来个极体（极体将来退化）退化）相同点相同点1.1.原始生殖原始生殖细细胞的增殖胞的增殖为为有有丝丝分裂分裂2.2.生殖生殖细细胞的成熟胞的成熟为为减数分裂减数分裂3.3.成熟成熟过过程均程均经经一次复制和两次分裂，子一次复制和两次分裂，子细细胞中染色体数目胞中染色体数目减半减半胚胎移植胚胎移植采集卵母细胞采集卵母细胞体外培养体外培养采集精子采集精子体外获能体外获能体外受精体外受精早期胚胎培养早期胚胎培养受体牛受体牛（时期时期：）1 1）超数排卵）超数排卵（试剂）（试剂）2 2）活体取卵）活体取卵（仪器）（仪器）3
17、3）从屠宰的卵巢取卵）从屠宰的卵巢取卵方法方法（方法，试剂方法，试剂）（试剂（试剂）（培养条件、目的阶段（培养条件、目的阶段）成熟的卵子成熟的卵子获能的精子获能的精子MIIMII中期中期方法方法胚胎工程胚胎工程选择选择供体母牛供体母牛受体母牛受体母牛同期发情处理同期发情处理超数排卵超数排卵供体公牛供体公牛配种配种冲卵冲卵质量检查、培养质量检查、培养胚胎移植胚胎移植妊娠检查妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）分娩（胚胎移植的犊牛）胚胎移植的基本程序：胚胎移植的基本程序：同期发情技术：同期发情技术：主要是借助外主要是借助外源激素剌激卵源激素剌激卵巢，使其按照巢，使其按照预定的要求发预定的要求发生变化，使处生变化，使处理母畜的卵巢理母畜的卵巢生理机能都处生理机能都处于相同阶段，于相同阶段，从而达到同期从而达到同期发情。发情。有性生殖 无性生殖 核移植技术、胚胎移植遵循 不遵循体外受精体外受精胚胎移植胚胎移植 试管动物 克隆动物生殖方式技术手段遗传物质遗传规律比较试管动物和克隆动物比较试管动物和克隆动物来自2个个体 主要来自核供体