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1、药物残留检测的基本原理药物残留检测的基本原理王玉峰王玉峰2013.04药物残留药物残留 主要包括农药残留和兽药残留、真菌毒素。主要包括农药残留和兽药残留、真菌毒素。农药残留农药残留 在农业生产中施用农药后一部分农药直接或间接残在农业生产中施用农药后一部分农药直接或间接残存于谷物、蔬菜、果品存于谷物、蔬菜、果品 、畜产品、水产品以及土壤和、畜产品、水产品以及土壤和水体中的现象。如滴滴涕，毒死蜱，马拉硫磷等。水体中的现象。如滴滴涕，毒死蜱，马拉硫磷等。兽药残留兽药残留 是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、如鸡蛋、奶品、肉品等奶品、肉品等)中原型药物或其
2、代谢产物。如氯霉素，中原型药物或其代谢产物。如氯霉素，克伦特罗，硝基呋喃等。克伦特罗，硝基呋喃等。真菌毒素真菌毒素黄曲霉素：黄曲霉素：B1、M1、B2、M2、G1、G2桔霉素：桔霉素：展青霉素：展青霉素：玉米赤霉类：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、玉米赤霉类：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、-玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮其它其它孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫糖皮质激素：泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可糖皮质激素：泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松的松、倍他米
3、松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松雌激素类：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚雌激素类：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚兽药残留检测方法兽药残留检测方法酶联免疫法：各种试剂盒酶联免疫法：各种试剂盒液质质联用仪：液质质联用仪：LC-MS/MS，三重四级杆质谱仪、杂合三，三重四级杆质谱仪、杂合三重四级杆重四级杆(QTRAP)试纸条：试纸条：微流控芯片：微流控芯片：微生物抑制法：微生物抑制法：高效液相色谱高效液相色谱第一部分第一部分 酶联免疫技术在药残检测和酶联免疫技术在药残检测和 病毒抗体检测中的应用病毒抗体检测中的应用酶联免疫检测的原理酶联免疫检测的原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫
4、活性。使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最
5、后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。优点：优点：灵敏度高灵敏度高(ppb)操作步骤易掌握；操作步骤易掌握；不足：不足：有些试剂盒价格昂贵有些试剂盒价格昂贵 易出现假阳性，导致实验反复易出现假阳性，导致实验反复酶联免疫检测兽药残留的方法类型酶联免疫检测兽药残留的方法类型三种必要的试剂：三种必要
6、的试剂：固相的抗原或抗体，固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶酶作用的底物。作用的底物。实例实例1.瘦肉精，磺胺类药残瘦肉精，磺胺类药残-间接竞争间接竞争ELISA法法(北京勤邦北京勤邦)在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，标品或样本中残留的在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，标品或样本中残留的克伦特罗和预包被抗原竞争抗克伦特罗的抗体，加入酶标二抗克伦特罗和预包被抗原竞争抗克伦特罗的抗体，加入酶标二抗后，用后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物克伦特罗负相关，底物显色，样本吸光值与残留物克伦特罗负相关，根据标准曲线，得出克伦特罗残留量。根据标准曲线，得出克伦特罗残留量。抗原抗
7、原抗体抗体二抗二抗酶标二抗酶标二抗TMB 底物底物瘦肉精瘦肉精-间接竞争间接竞争ELISA法法孵育孵育+Substance+Substance+Substance加底物加底物显色显色3,3，5,5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)TMB 氧化产物氧化产物加硫酸终止液后加硫酸终止液后ELISA显色机理显色机理实例实例2.氯霉素氯霉素-直接竞争直接竞争ELISA法法(杭州迪恩杭州迪恩)标品或样品中的游离氯霉素与酶标记的氯霉素竞争结合酶标品或样品中的游离氯霉素与酶标记的氯霉素竞争结合酶标板微孔中固相化的抗氯霉素抗体，通过清洗洗掉未结合的酶标板微孔中固相化的抗氯霉素抗体，通过清洗洗掉未结合的酶标记氯
8、霉素，通过添加底物显色。样品的吸光值与浓度成负相标记氯霉素，通过添加底物显色。样品的吸光值与浓度成负相关，根据标准曲线，得出氯霉素的残留量。关，根据标准曲线，得出氯霉素的残留量。磺胺七合一直接竞争磺胺七合一直接竞争ELISA法法(天津九鼎天津九鼎)酶联免疫检测兽药残留的方法类型酶联免疫检测兽药残留的方法类型抗体抗体氯霉素氯霉素酶标酶标-氯霉素氯霉素孵育孵育+Substance+Substance+Substance加底物加底物显色显色氯霉素氯霉素-直接竞争直接竞争ELISA法法酶联免疫检测兽药残留的方法类型酶联免疫检测兽药残留的方法类型实例实例3.硝基呋喃硝基呋喃-间接竞争间接竞争ELISA法
9、法(无锡同昕无锡同昕)ELISA原理类似于瘦肉精的检测，不同之处是硝基呋喃需要衍生。原理类似于瘦肉精的检测，不同之处是硝基呋喃需要衍生。硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，代谢物在组织中则能存留硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，代谢物在组织中则能存留较长的一段时间，所以我们检测的实为硝基呋喃的代谢物。由于代谢物较长的一段时间，所以我们检测的实为硝基呋喃的代谢物。由于代谢物均为较小分子，属于半抗原，因此制备其抗体时，需要进行衍生后，免均为较小分子，属于半抗原，因此制备其抗体时，需要进行衍生后，免疫动物获得抗体疫动物获得抗体(也有可能是单克隆抗体也有可能是单克隆抗体)。此处的衍生试剂还没有确定是
10、否和此处的衍生试剂还没有确定是否和GB中的衍生化试剂类似？中的衍生化试剂类似？抗原抗原抗体抗体二抗二抗酶标二抗酶标二抗硝基呋喃硝基呋喃-间接竞争间接竞争ELISA法法孵育孵育+Substance+Substance+Substance加底物加底物显色显色实例实例4.伪狂犬病病毒伪狂犬病病毒(PRV)直接竞争直接竞争ELISA法法 在酶标板微孔条上预包被在酶标板微孔条上预包被PRV的抗原的抗原PRV gB，阳性对照或样本中的抗，阳性对照或样本中的抗体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗PRV gB的单克隆抗体，
11、第二次孵育时酶标单抗和样本中的抗体竞争吸附微的单克隆抗体，第二次孵育时酶标单抗和样本中的抗体竞争吸附微孔条中的抗原。再次清洗微孔后加入底物孔条中的抗原。再次清洗微孔后加入底物TMB显色，加入酶标二抗后，用显色，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与抗体浓度负相关。即免疫成功，产生了抗体，底物显色，样本吸光值与抗体浓度负相关。即免疫成功，产生了抗体，显色的显色的OD630值小于阴性对照。值小于阴性对照。抗典型性猪流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血清的检测均采用直接竞争抗典型性猪流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血清的检测均采用直接竞争ELISA法。法。酶联免疫检测病毒抗体的方法类型酶联免疫检测病毒抗体
12、的方法类型抗原抗原抗体抗体酶标抗体酶标抗体(PRV)疫苗直接竞争疫苗直接竞争ELISA法法加底物加底物加底物加底物加底物加底物阴性阴性阳性阳性孵育孵育(1)显色显色孵育孵育(2)实例实例5.猪繁殖与呼吸道综合症猪繁殖与呼吸道综合症(蓝耳病，蓝耳病，PRRS/US)的间接的间接ELISA法法 在酶标板微孔条上预包被在酶标板微孔条上预包被PRRS/US的抗原，阳性对照或样本中的抗体的抗原，阳性对照或样本中的抗体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗猪的在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗猪的二抗，第二次孵育时酶标二抗和抗原抗体复合物结合。再次清洗微孔后
13、加二抗，第二次孵育时酶标二抗和抗原抗体复合物结合。再次清洗微孔后加入底物入底物TMB显色，样本吸光值与抗体浓度正相关。即免疫成功，产生了抗显色，样本吸光值与抗体浓度正相关。即免疫成功，产生了抗体，显色的体，显色的OD450值大于阴性对照。值大于阴性对照。酶联免疫检测病毒抗体的方法类型酶联免疫检测病毒抗体的方法类型抗原抗原抗体抗体二抗二抗酶标二抗酶标二抗PRRS/US疫苗的间接疫苗的间接ELISA法法阴性阴性阳性阳性孵育孵育(1)孵育孵育(2)加底物加底物加底物加底物加底物加底物显色显色第二部分：液质质联用技术在药残第二部分：液质质联用技术在药残检测中的应用检测中的应用液质质联用技术液质质联用技
14、术 药物在体内经过肝肾等器官的代谢被转化后，经尿液和药物在体内经过肝肾等器官的代谢被转化后，经尿液和粪便排出体外，只有极少部分残留在肌肉组织，在肝脏和肾粪便排出体外，只有极少部分残留在肌肉组织，在肝脏和肾脏中的浓度较高，但总体浓度均在脏中的浓度较高，但总体浓度均在ppb级级(g/kg=ng/mL)。痕。痕量检测最常用的方式是酶联免疫试剂盒和液相量检测最常用的方式是酶联免疫试剂盒和液相-质谱质谱/质谱联用质谱联用技术。技术。液质质联用技术，顾名思义将液相色谱的高效分离和液质质联用技术，顾名思义将液相色谱的高效分离和质谱的高灵敏度有机结合，串联质谱更提高了检测结果的质谱的高灵敏度有机结合，串联质谱
15、更提高了检测结果的准确性。液质质联用是药残检测最常用的检测方法之一，准确性。液质质联用是药残检测最常用的检测方法之一，在国标，欧盟和美国标准中被广泛采纳。在国标，欧盟和美国标准中被广泛采纳。液质质联用仪简图液质质联用仪简图离子源离子源离子传输离子传输离子过滤离子过滤离子碰撞离子碰撞离子过滤离子过滤离子检测离子检测三重四级杆三重四级杆(Q1Q2Q3)工作原理工作原理MS1(母离子选择母离子选择)MS2(子离子选择子离子选择)质量分析器工作原理质量分析器工作原理兽药残留兽药残留氯霉素类：氯霉素类：氯霉素氯霉素(0.1ppb)、甲砜霉素甲砜霉素和和氟苯尼考氟苯尼考(1ppb)硝基呋喃：硝基呋喃：呋喃
16、它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮(0.5ppb)红霉素类：红霉素类：红霉素、替米考星、泰乐菌素红霉素、替米考星、泰乐菌素、林可霉素、螺旋霉素、交沙霉素、林可霉素、螺旋霉素、交沙霉素、吉他霉素、克林霉素和竹桃霉素吉他霉素、克林霉素和竹桃霉素(1ppb)四环素类：四环素类：土霉素、金霉素、四环素和强力霉素土霉素、金霉素、四环素和强力霉素(5ppb)-受体激动剂：受体激动剂：沙丁胺醇沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、特布他林、塞曼特罗、塞布特罗、莱克多巴胺、克伦莱克多巴胺、克伦特罗、特罗、溴布特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗、溴代克伦特罗溴布特罗、苯
17、氧丙酚胺、马布特罗、马贲特罗、溴代克伦特罗镇定剂：镇定剂：乙酰丙嗪、乙酰丙嗪、氯丙嗪氯丙嗪、异丙嗪、丙酰丙嗪、甲苯噻嗪、异丙嗪、丙酰丙嗪、甲苯噻嗪、地西泮地西泮喹诺酮类：喹诺酮类：伊诺沙星、伊诺沙星、氧氟沙星氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星环丙沙星、洛美沙星、洛美沙星、丹诺沙星、丹诺沙星、恩诺沙星恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星和司帕沙星、沙拉沙星、双氟沙星和司帕沙星磺胺类：磺胺类：磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑。磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑。青霉素类：头孢氨苄、头孢拉定、。青霉素类：头孢氨苄、头孢拉定、。硝基咪唑类：硝基咪唑类：4-硝基咪唑、异丙硝唑、硝基咪唑、异丙硝唑、2-甲硝咪唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氯甲硝甲硝咪唑、洛硝哒唑、甲硝唑、氯甲硝咪唑、地美硝唑、苯硝咪唑及代谢物羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑咪唑、地美硝唑、苯硝咪唑及代谢物羟基甲硝唑和羟甲基甲硝咪唑瘦肉精的定量检测瘦肉精的定量检测谢谢大家！谢谢大家！