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1、植物病原细菌研究方法植物病原细菌研究方法植物保护学研究方法系列专题植物保护学研究方法系列专题内容提纲：内容提纲：细菌的基本形态特征常规细菌生理生化检测方法细菌种类鉴定方法植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法有益细菌的利用研究细菌的基本形态特征细菌的基本形态特征 细菌细菌（bacteriabacteria）是单细胞原核微生物，）是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。细菌的形态和大小细菌的形态和大小细菌的细胞结构细菌的细胞结构细菌的繁殖与群体形态细菌的繁殖与群体形态（
2、一）细菌的大小（一）细菌的大小细菌大小的测定：细菌大小的测定：(1)测量：测量：测微尺测微尺(2)长度单位：长度单位：微米微米(m)(3)表示：表示：球菌：球菌：直径直径 杆菌：杆菌：宽宽长长 螺菌：螺菌：宽、长、螺距宽、长、螺距 通常通常球菌直径球菌直径：0.2 0.2 1.51.5 mm，杆菌杆菌:长长1 1 5 m,5 m,宽宽0.50.5 1 m 1 m。例如：例如：大肠杆菌：平均长度：大肠杆菌：平均长度：2 m 2 m；宽度宽度0 0.5.5mm 15001500个大肠杆菌头尾相接等于个大肠杆菌头尾相接等于3 3mm;mm;10 109 9个大肠杆菌重个大肠杆菌重1 1 mg.mg.
3、由于菌种由于菌种不同不同，细菌的大小存在很大的差异；对于同，细菌的大小存在很大的差异；对于同一个菌种，细胞的大小也常随着菌龄变化。另外，对于同一个菌种，细胞的大小也常随着菌龄变化。另外，对于同一个菌种染色前后其细胞大小都有所不同。所以，有关细一个菌种染色前后其细胞大小都有所不同。所以，有关细菌大小的记载，常是平均值或代表性数值。菌大小的记载，常是平均值或代表性数值。菌名菌名菌名菌名 直径或宽直径或宽直径或宽直径或宽长长长长 （m m m m）乳链球菌乳链球菌乳链球菌乳链球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆
4、菌枯草芽孢杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌 0.5 10.5 1 0.8 1 0.8 1 0.5 (1 3)0.5 (1 3)(0.8 1.2)(1.23)(0.8 1.2)(1.23)(0.2 0.6)(0.2 0.6)(1(1 3 3)细菌细胞的大小细菌细胞的大小（二）、（二）、细菌的形态细菌的形态 不不同同细细菌菌的的形形态态可可以以说说是是千千差差万万别别，丰丰富富多多彩彩，但但就就单单个个有有机机体体而而言言，其其基基本本形形态态可可分分为为球球状状、杆杆状状与与螺螺旋状旋状三种三种.除除了了球球菌菌、杆杆菌菌、蛆蛆旋旋菌菌三三种种基基本本形形态态外外，还还有有许许多多具具其其他
5、他形形态态的的细细菌菌。例例如如柄柄杆杆菌菌细细胞胞上上有有柄柄、菌菌丝丝、附附器器等等细细胞胞质质伸伸出出物物，细细胞胞呈呈杆杆状状或或梭梭状状，并并有有特特征征性性的的细细柄柄；球球衣衣菌菌能能形形成成衣衣峭峭，杆杆状状的的细细胞胞呈呈链链状状排排列列在在衣衣鞘鞘内内而而成成为为丝丝状状,而而支支原原体体由由于于只只有有细细胞胞膜膜，没没有有纫纫胞胞壁壁，故故细细胞胞柔柔软软，形形态态多多变变，具具有有高高度度多多形形性性。另另外外，人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌。人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌。球状、杆状和螺旋状球状、杆状和螺旋状细菌的三种基本形态细菌的三种基本形态:1.球 菌单
6、球菌单球菌双球菌双球菌链球菌链球菌四联球菌四联球菌八叠球菌八叠球菌 葡萄球菌葡萄球菌2.2.杆菌杆菌 杆菌是细菌中种类最多的类型杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。杆菌的形态：杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、“八八”字状以及有鞘衣的丝状等。字状以及有鞘衣的丝状等。2.2.杆杆 菌菌短杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌链状杆菌单杆菌2.2.杆杆 菌菌
7、杆菌细胞两端的形态特征杆菌细胞两端的形态特征2.2.杆杆 菌菌3 3、螺旋菌、螺旋菌螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：弧菌：弧菌：弧菌：弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌例：霍乱弧菌、逗号弧菌例：霍乱弧菌、逗号弧菌例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌：螺旋菌：螺旋菌：螺旋菌：螺旋满螺旋满螺旋满螺旋满2 2 2 26 6 6 6环，螺旋状环，
8、螺旋状环，螺旋状环，螺旋状 例：干酪螺菌例：干酪螺菌例：干酪螺菌例：干酪螺菌 螺旋体：螺旋体：螺旋体：螺旋体：旋转周数在旋转周数在旋转周数在旋转周数在6 6 6 6环以上，菌体柔软。环以上，菌体柔软。环以上，菌体柔软。环以上，菌体柔软。例：梅毒密螺旋体例：梅毒密螺旋体例：梅毒密螺旋体例：梅毒密螺旋体螺旋菌弧菌螺旋体3 3、螺旋菌、螺旋菌 细菌的特殊形态：细菌的特殊形态：柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细 菌、贝日阿托氏菌菌、贝日阿托氏菌(丝状丝状)、具有子实体的粘、具有子实体的粘细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。细菌的特殊形态
9、细菌的特殊形态二、细菌的细胞结构二、细菌的细胞结构u基本结构包括：基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、间体、核糖体、气泡和储藏物。间体、核糖体、气泡和储藏物。u特殊结构包括：特殊结构包括：荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。细菌细胞结构细菌细胞结构1.1.固体斜面培养固体斜面培养 2.2.液体培养基液体培养基 3.3.半固体培养半固体培养n n植物病原细菌概述植物病原细菌概述绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为25-25-25-25-28
10、282828，少数可以，少数可以，少数可以，少数可以20202020或在或在或在或在35353535中（如青枯菌）生中（如青枯菌）生中（如青枯菌）生中（如青枯菌）生长。长。长。长。植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比较敏感，一般在较敏感，一般在较敏感，一般在较敏感，一般在50505050左右的热水中处理左右的热水中处理左右的热水中处理左右的热水中处理10101010分钟即分钟即分钟即分钟即失活，适宜的失活，适宜的失活，适宜的失活，适宜的pHpHpHpH为为为为6-76-76-76
11、-7。n植物病原细菌的革兰氏染色（细菌的革兰氏染色反应是细菌分类鉴定的一个重要特征）（细菌的革兰氏染色反应是细菌分类鉴定的一个重要特征）常规细菌生理生化检测方法常规细菌生理生化检测方法细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构v革兰氏革兰氏阳性阳性菌细胞壁：菌细胞壁：由肽聚糖和磷壁酸组成由肽聚糖和磷壁酸组成 磷壁酸：磷壁酸：磷壁酸：磷壁酸：占占40%40%。G G+菌菌所特有所特有,其主链由数十个其主链由数十个磷酸甘油或磷酸核糖醇磷酸甘油或磷酸核糖醇组成组成,有的还有由有的还有由D DAlaAla和还原糖组成的侧链。和还原糖组成的侧链。肽聚糖肽聚糖:占3070%,不同菌种中肽聚糖(肽链)组分不同。v革兰
12、氏革兰氏阴性阴性菌细胞壁：菌细胞壁：分内壁层和外壁层。分内壁层和外壁层。内壁层：内壁层：紧贴胞膜,仅由12层肽聚糖分子构成,占细胞壁干重5-10%,无磷壁酸。外壁层：外壁层：位于肽聚糖层的外部。脂多糖;脂蛋白、包括:蛋白质层:基质蛋白、外壁蛋白;磷脂.v革兰氏染色的原理革兰氏染色的原理v革兰氏染色原理：革兰氏染色原理：第一步：第一步：结晶紫使菌体着上紫色；结晶紫使菌体着上紫色；第二步：第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内；壁阻留在细胞内；第三步：第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反酒精脱色，细胞壁成分和构
13、造不同，出现不同的反应；应；G G+菌：菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；GG菌：菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色
14、，细胞无色，沙黄复染后呈红色。呈红色。革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生麦医生Hans Christian GramHans Christian Gram于于18841884年年创立创立。基本步骤：基本步骤：涂片固定涂片固定 结晶紫初染结晶紫初染1min1min 碘液媒染碘液媒染1min1min95%95%乙醇脱色乙醇脱色0.5min0.5min 番红复染番红复染minmin 结果结果:革兰氏革兰氏阳性菌阳性菌紫色紫色；革兰氏革兰氏阴性菌阴性菌红色红色。革兰氏染色法：革兰氏染色法：实验材料实验材料 待测细菌待测细菌 枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌
15、（G+）甘蓝黑腐病菌（甘蓝黑腐病菌（G-）染液：染液：结晶紫草酸铵染剂、鲁戈尔碘液、复染剂（番红结晶紫草酸铵染剂、鲁戈尔碘液、复染剂（番红O）用具：用具：移植饵、清洁无脂载玻片移植饵、清洁无脂载玻片清洁无脂载玻片阳性对照菌阳性对照菌（紫色或蓝黑色）（紫色或蓝黑色）待待 测测 菌菌阴性对照菌阴性对照菌（红色）示范图示范图对照菌呈现正确颜色，实验才为成功对照菌呈现正确颜色，实验才为成功涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色1min水洗、吸干镜检镜检简单染色制备涂片标本制备涂片标本染色染色阳性菌阳性菌阴性菌阴性菌革兰氏染色法革兰氏染色法革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性大肠杆菌大肠杆
16、菌大肠杆菌大肠杆菌革兰氏染色阳性革兰氏染色阳性枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 注：注：（1）、）、实验细菌为活跃生长期的培养物；实验细菌为活跃生长期的培养物；（2）、）、菌液不能太浓，涂片不宜过厚，造成假阳性；菌液不能太浓，涂片不宜过厚，造成假阳性；（3）、）、火焰固定涂片，以载玻片不烫手为宜；火焰固定涂片，以载玻片不烫手为宜；（4）、）、脱色时间把握好，过长，假阴性；过短，假阳性。脱色时间把握好，过长，假阴性；过短，假阳性。鞭毛：鞭毛：某些细菌表面由细胞内生出的细长、波曲、某些细菌表面由细胞内生出的细长、波曲、毛发状的结构。毛发状的结构。鞭毛具有运动功能，一般认为鞭毛靠鞭毛丝旋转而鞭毛具有运动功能
17、，一般认为鞭毛靠鞭毛丝旋转而动，动，它们是细菌的它们是细菌的“运动器官运动器官”。鞭毛的长度：鞭毛的长度：一般为一般为151520 20 m m，最长可达，最长可达70 70 m m。鞭毛的直径：鞭毛的直径：为为0.010.010.02 0.02 m.m.不同细菌的鞭毛数目和着生位置不同，鞭毛数目一不同细菌的鞭毛数目和着生位置不同，鞭毛数目一般一至数十条。般一至数十条。细菌鞭毛染色鞭毛的着生方式：鞭毛的着生方式：周生周生鞭毛的化学组成：鞭毛的化学组成：主要由鞭毛蛋白构成，还含有少量的多糖、主要由鞭毛蛋白构成，还含有少量的多糖、脂类和核酸等。脂类和核酸等。鞭毛起源于细胞质膜内侧的基粒。鞭毛起源于
18、细胞质膜内侧的基粒。细胞质区内有一个颗粒状小体，此小体为细胞质区内有一个颗粒状小体，此小体为基粒，鞭毛自基粒长出穿过细胞壁延伸到细胞基粒，鞭毛自基粒长出穿过细胞壁延伸到细胞外部。外部。鞭毛的结构：鞭毛的结构：鞭毛丝鞭毛丝鞭毛鞭毛 鞭毛钩鞭毛钩 基体基体鞭毛的观察：鞭毛的观察：电镜电镜特殊鞭毛染色，在光学显微镜下观察特殊鞭毛染色，在光学显微镜下观察半固体穿刺培养半固体穿刺培养从固体培养基上的菌落形态判断从固体培养基上的菌落形态判断一般情况下：一般情况下：菌落形状大，薄且不规则，边缘极不平整，可能有鞭毛。菌落形状大，薄且不规则，边缘极不平整，可能有鞭毛。菌落十分圆滑，边缘平整且相对较厚，可能没有鞭
19、毛。菌落十分圆滑，边缘平整且相对较厚，可能没有鞭毛。实验菌种及药品实验菌种及药品 1菌种：菌种：枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 2染液染液 染液染液A：单宁酸单宁酸 5.0g 氯化铁（氯化铁（Fecl36H2O）1.5g 福尔马林（福尔马林（15）2.0ml（15%福尔马林：福尔马林：40%甲醛甲醛4ml+蒸馏水蒸馏水6ml）NaOH(1%)1.0ml 蒸馏水蒸馏水 100ml 染液染液B：硝酸银硝酸银 2g 蒸馏水蒸馏水 100ml三、染色方法：三、染色方法：银盐染色法银盐染色法 硝酸银溶于蒸馏水中。取硝酸银溶于蒸馏水中。取10ml作回滴用，向其余作回滴用，向其余90ml硝酸银溶液中逐滴加浓氢氧化
20、铵，先形成很浓的沉淀，再硝酸银溶液中逐滴加浓氢氧化铵，先形成很浓的沉淀，再继续滴加浓氢氧化铵至沉淀消失为止。然后慢慢滴入备用继续滴加浓氢氧化铵至沉淀消失为止。然后慢慢滴入备用的硝酸银溶液则出现少量雾状沉淀，但轻轻摇动后，沉淀的硝酸银溶液则出现少量雾状沉淀，但轻轻摇动后，沉淀又消失，再滴入硝酸银溶液，直到摇动后雾状沉淀不再消又消失，再滴入硝酸银溶液，直到摇动后雾状沉淀不再消失为止。此液不耐保存，失为止。此液不耐保存，4小时内染色效果最佳。小时内染色效果最佳。菌体菌体鞭毛鞭毛菌体菌体鞭毛鞭毛菌体菌体鞭毛鞭毛芽孢芽孢 概念：概念：某些菌生长到一某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一定阶段，细胞内形成一个
21、圆形、椭圆形或卵圆个圆形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不形的内生孢子，是对不良环境有较强抵抗力的良环境有较强抵抗力的休眠体。休眠体。芽芽孢孢能形成芽孢的细菌种类：能形成芽孢的细菌种类：在杆菌中能形成芽孢的种类在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。产生芽孢的几个属：产生芽孢的几个属：芽孢杆菌属芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属芽孢乳杆菌属芽孢乳杆菌属生孢八叠球菌属（其中的一个种）生孢八叠球菌属（其中的一个种）芽孢芽孢的形态及其的形态及其在细胞中的位置：在细胞中的位置：A A 近中央近中央 B B 末端末端 C C
22、 中央中央 细菌芽孢的各种类型细菌芽孢的各种类型芽孢的组成和结构芽孢的组成和结构 芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心.芽孢的结构芽孢的结构芽孢的外壁层厚而致密，主要成芽孢的外壁层厚而致密，主要成分为脂蛋白，通透性差分为脂蛋白，通透性差,不易着色。不易着色。核心含有大量的核心含有大量的DNADNA、RNARNA、蛋白蛋白质酶等物质，还含有质酶等物质，还含有2,62,6吡啶二吡啶二羧酸羧酸（DPADPA）,DPA,DPA是芽孢特有的成是芽孢特有的成分。一般以分。一般以 DPADPACaCa的形式存在的形式存在。皮层主要含芽孢肽聚糖、
23、皮层主要含芽孢肽聚糖、DPADPACaCa，皮层体积大，比较致密。皮层体积大，比较致密。芽孢平均含水量低芽孢平均含水量低,约约40%.40%.芽孢的特性芽孢的特性:具有很强的具有很强的抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。含水量低、壁厚而致密，通透性差含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色。不易着色。新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。一个芽孢萌发产生一个个体。一个芽孢萌发产生一个个体。芽孢的抗热机制：芽孢的抗热机制：目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、壁厚而致密，芽
24、孢中的酶分子量小，比较耐热。壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。芽孢染色芽孢染色（孔雀绿藏红染色）染剂染剂 孔雀绿水溶液孔雀绿水溶液 5 染剂染剂 藏红水溶液藏红水溶液 0.5 或或 碱性品红水溶液碱性品红水溶液 0.05染色方法：染色方法：1、涂片固定；、涂片固定；2、加染剂、加染剂在酒精灯火焰上加热染色在酒精灯火焰上加热染色1min，勿使染液沸腾和干燥；，勿使染液沸腾和干燥；3、水洗；、水洗；4、染剂、染剂染色染色15s；5、水洗，风干后镜检。菌体染成红色，芽孢染成绿色。、水洗，风干后镜检。菌体染成红色，芽孢染成绿色。芽孢芽孢菌体菌体n n常规鉴定方法常规鉴定方法n n全自动微生物鉴
25、定仪全自动微生物鉴定仪-Biolog植物病原细菌的鉴定方法植物病原细菌的鉴定方法菌落特征比较菌落特征比较常规细菌鉴定方法参考：参考：东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001全自动微生物鉴定仪全自动微生物鉴定仪-Biologn n鉴定原理鉴定原理BiologBiologBiologBiolog公司独创的公司独创的公司独创的公司独创的碳源碳源碳源碳源利用方法，利用微生物对不同利用方法，利用微生物对不同利用方法，利用微生物对不同利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选碳源代谢率的差异
26、，针对每一类微生物筛选碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95959595种不同碳源，种不同碳源，种不同碳源，种不同碳源，配合四唑类显色物质（如配合四唑类显色物质（如配合四唑类显色物质（如配合四唑类显色物质（如TTCTTCTTCTTC、TVTVTVTV），固定于），固定于），固定于），固定于96969696孔板上孔板上孔板上孔板上（A1A1A1A1孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的检测微生物细胞
27、利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应氧化还原酶与显色物质发生反应氧化还原酶与显色物质发生反应氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光而导致的颜色变化（吸光而导致的颜色变化（吸光而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），与标与标与标与标准菌株数据库进行比对准菌株数据库进行比对准菌株数据库进行比对准菌
28、株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。，即可得出最终鉴定结果。，即可得出最终鉴定结果。，即可得出最终鉴定结果。n n主要特点主要特点主要特点主要特点 快速读取结果快速读取结果快速读取结果快速读取结果鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动分析、记录和就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动分析、记录和就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动
29、分析、记录和就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动分析、记录和打印。打印。打印。打印。强大的数据库强大的数据库强大的数据库强大的数据库BiologBiolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计括细菌、酵母和丝状真菌在内总计括细菌、酵母和丝状真菌在内总计括细菌、酵母和丝状真菌在内总计19731973种微生物，几乎涵盖了所有种微生物，几乎涵盖了所有种微生物，几乎涵盖了所有种微生物，几乎涵盖了所有的人类、
30、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。n nBIOLOGBIOLOG在植物病原菌鉴定方面在植物病原菌鉴定方面可鉴定常见的可鉴定常见的可鉴定常见的可鉴定常见的假单胞菌假单胞菌假单胞菌假单胞菌(PseudomonasPseudomonasPseudomonasPseudomonas,77,77,77,77种种种种)、伯克霍伯克霍伯克霍伯克霍尔德菌尔德菌尔德菌尔德菌(BurkholderiaBurkholderiaBurkholderiaBurkholderia)
31、、黄单孢菌属黄单孢菌属黄单孢菌属黄单孢菌属(XanthomonasXanthomonasXanthomonasXanthomonas)、果果果果胶杆菌属胶杆菌属胶杆菌属胶杆菌属(PectobacteriumPectobacteriumPectobacteriumPectobacterium)、食酸菌属食酸菌属食酸菌属食酸菌属(AcidovoraxAcidovoraxAcidovoraxAcidovorax)、根瘤菌属根瘤菌属根瘤菌属根瘤菌属(RhizobiumRhizobiumRhizobiumRhizobium)等近等近等近等近200200200200种植物致病菌，特别适合种植物致病菌，特别
32、适合种植物致病菌，特别适合种植物致病菌，特别适合各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研究用。究用。究用。究用。n nBIOLOGBIOLOGBIOLOGBIOLOG在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，包括包括包括包括70707070多种乳酸菌多种乳酸菌多种乳酸菌多种乳酸菌、30303030多种双歧杆菌多种双歧杆菌
33、多种双歧杆菌多种双歧杆菌及各类常见的食品及各类常见的食品及各类常见的食品及各类常见的食品必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌杆菌杆菌杆菌(含阪崎肠杆菌含阪崎肠杆菌含阪崎肠杆菌含阪崎肠杆菌)、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化妆品行弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化妆品行弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化
34、妆品行弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化妆品行业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控制及产品研发等。制及产品研发等。制及产品研发等。制及产品研发等。n nBIOLOGBIOLOG专门分开提供一个专门分开提供一个专门分开提供一个专门分开提供一个DP(DP(危险微生物危险微生物危险微生物危险微生物)数据库，包数据库，包数据库，包数据库，包含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、含鼠疫
35、耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽假单孢菌鼻疽假单孢菌鼻疽假单孢菌鼻疽假单孢菌)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌等森氏菌、蜡样芽胞杆菌等森氏菌、蜡样芽胞杆菌等森氏菌、蜡样芽胞杆菌等1212种强致病微生物，适用于国种强致病
36、微生物，适用于国种强致病微生物，适用于国种强致病微生物，适用于国家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武器检测及防治研究。器检测及防治研究。器检测及防治研究。器检测及防治研究。目前广泛用于美国军方进行生物恐目前广泛用于美国军方进行生物恐目前广泛用于美国军方进行生物恐目前广泛用于美国军方进行生物恐怖检测及预防研究。怖检测及预防研究。怖检测及预防研究。怖检测及预防研究。n n鉴定鉴定鉴定鉴定初始初始初始初始首先按常规微生物操作方法分离出纯种。首先按
37、常规微生物操作方法分离出纯种。n n鉴定步骤如下：鉴定步骤如下：第一步第一步用用BiologBiolog专用培养基将纯种扩大培养。专用培养基将纯种扩大培养。第二步第二步按要求配制一定浊度按要求配制一定浊度(细胞浓度细胞浓度)的菌悬液。的菌悬液。第三步第三步将菌悬液接种至微孔鉴定板将菌悬液接种至微孔鉴定板(Microplate)(Microplate)，培养一定时间。，培养一定时间。第四步第四步 将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。植物病原细菌检测和细菌病害植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法诊断方法一、症状特征一、症状特
38、征十字花科软腐病十字花科软腐病瓜萎蔫病瓜萎蔫病肿瘤肿瘤n n 由由由由细细细细菌菌菌菌侵侵侵侵染染染染所所所所致致致致病病病病害害害害的的的的病病病病部部部部，无无无无论论论论是是是是维维维维管管管管束束束束系系系系统统统统受受受受害害害害的的的的，还还还还是是是是薄薄薄薄壁壁壁壁组组组组织织织织受受受受害害害害的的的的，都都都都可可可可以以以以在在在在徒徒徒徒手手手手切切切切片片片片中中中中看看看看到到到到有有有有大大大大量量量量细细细细菌菌菌菌从从从从病病病病部部部部喷喷喷喷出出出出，这这这这种种种种现现现现象象象象称称称称为为为为菌菌菌菌溢溢溢溢现现现现象象象象(bacteria bac
39、teria exudationexudation，BEBE)。菌菌菌菌溢溢溢溢现现现现象象象象为为为为细细细细菌菌菌菌病病病病害害害害特特特特有有有有，是是是是区区区区分分分分细细细细菌菌菌菌病害或真菌、病毒病害的最简便的手段之一。病害或真菌、病毒病害的最简便的手段之一。病害或真菌、病毒病害的最简便的手段之一。病害或真菌、病毒病害的最简便的手段之一。二、显微镜检查二、显微镜检查 （菌溢现象）（菌溢现象）菌溢现象操作方法菌溢现象操作方法n n细菌病害的病组织，内含有大量菌体，可通过菌细菌病害的病组织，内含有大量菌体，可通过菌细菌病害的病组织，内含有大量菌体，可通过菌细菌病害的病组织，内含有大量菌
40、体，可通过菌溢现象或诊断，具体方法：溢现象或诊断，具体方法：溢现象或诊断，具体方法：溢现象或诊断，具体方法：取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。加一滴无菌水后，加盖玻片。加一滴无菌水后，加盖玻片。加一滴无菌水后，加盖玻片。加一滴无菌水后，加盖玻片。低倍镜下，暗光，观察。低倍镜下，暗光，观察。低倍镜下，暗光，观察。低倍镜下，暗光，观察。可看到病斑切口处有大量细菌云雾状涌出。可看到病斑切口处有大量细菌云雾状涌出。可看到病斑切口处有大量细菌云雾状涌出。可看到病斑切口处有大量细菌
41、云雾状涌出。菌溢现象菌溢现象 1、凝集反应、凝集反应v 颗粒性抗原如细菌与其特异性抗体在电解质影响下，很快结合颗粒性抗原如细菌与其特异性抗体在电解质影响下，很快结合成可见的凝集块。成可见的凝集块。载玻片凝集载玻片凝集反应是最快速的测定方法：在清洁载玻片上加两反应是最快速的测定方法：在清洁载玻片上加两滴生理盐水配的菌悬液，用移植环取少量抗血清与其中一滴菌滴生理盐水配的菌悬液，用移植环取少量抗血清与其中一滴菌悬液混合，另一滴不加血清作为对照。经悬液混合，另一滴不加血清作为对照。经35分钟，可以看到原分钟，可以看到原来均匀悬浮的细菌凝集成团，对照则不发生这种变化。来均匀悬浮的细菌凝集成团，对照则不发
42、生这种变化。另一种常用方法是另一种常用方法是试管凝集试管凝集反应，虽然没有玻片凝集反应快反应，虽然没有玻片凝集反应快捷，但能测定捷，但能测定血清效价血清效价和作定量研究。和作定量研究。分子生物学检测技术分子生物学检测技术 2、酶联免疫吸附法、酶联免疫吸附法 （Enzyme linked immune sorbent assay,ELISA）v 该方法是将微量的酶与测定的抗原或抗体结合，大大的提高抗原和抗该方法是将微量的酶与测定的抗原或抗体结合，大大的提高抗原和抗体反应的灵敏度。体反应的灵敏度。抗体夹心抗体夹心ELISA法通常比其他法通常比其他ELISA方法敏感方法敏感25倍。倍。先用抗体包被聚
43、苯乙烯微量滴定板孔，然后加测定抗原样本，先用抗体包被聚苯乙烯微量滴定板孔，然后加测定抗原样本，抗原被抗体吸附，然后将酶联抗体加在被吸附的抗原上。最后再加抗原被抗体吸附，然后将酶联抗体加在被吸附的抗原上。最后再加酶的底物，酶催化底物而显色，用分光光度计检测。酶的底物，酶催化底物而显色，用分光光度计检测。4 4、核酸杂交及、核酸杂交及PCR诊断技术诊断技术 v 利用核酸链间碱基配对利用核酸链间碱基配对核酸杂交来识别特定核酸顺序的方法。核酸杂交来识别特定核酸顺序的方法。将一个预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段，加以标记，就将一个预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段，加以标记，就成为成为核酸探针核酸
44、探针(probe)(probe)。用核酸探针可以探测待查标本核酸中与探针具有互补的碱基顺用核酸探针可以探测待查标本核酸中与探针具有互补的碱基顺序。序。如果两者有互补顺序则杂交成功如果两者有互补顺序则杂交成功,结果阳性结果阳性;若待查若待查标本核酸与探针顺序无关则杂交失败标本核酸与探针顺序无关则杂交失败,结果呈阴性。结果呈阴性。由于大多数植物病毒的核酸是由于大多数植物病毒的核酸是RNA,RNA,其探针为互补其探针为互补DNA DNA(complementary DNA,cDNA)(complementary DNA,cDNA)，称为，称为cDNAcDNA探针探针。4.1 核酸杂交核酸杂交 核酸杂
45、交核酸杂交 4.2 PCR诊断技术诊断技术聚合酶链式反应聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）是一种体）是一种体外扩增特异性外扩增特异性DNA的技术，在短时间内可以大量扩增核酸。的技术，在短时间内可以大量扩增核酸。整个扩增包括整个扩增包括3 3个重复的步骤：（个重复的步骤：（1 1）DNADNA热变性，双链变单链；热变性，双链变单链；（2 2）引物退火，当温度降低时，两个引物分别结合到靶）引物退火，当温度降低时，两个引物分别结合到靶DNADNA的两的两条链的条链的33末端，（末端，（3 3）引物延伸，在）引物延伸，在DNADNA聚合酶的催化下，引物由聚合酶
46、的催化下，引物由5533扩增扩增延长。分别和相对的延长。分别和相对的DNADNA链互补。链互补。n nReal-timefluorescentPCRn nREP-PCRn nImmuno-PCRn nRAPD-PCRn nNested-PCR在植物病原细菌检测和鉴定中应用的在植物病原细菌检测和鉴定中应用的PCR技术技术n n 三、分离培养与致病性测定三、分离培养与致病性测定 培培培培养养养养基基基基稀稀稀稀释释释释法法法法或或或或划划划划线线线线法法法法培培培培养养养养。观观观观察察察察单单单单个个个个菌落特点。菌落特点。菌落特点。菌落特点。将将将将分分分分离离离离的的的的细细细细菌菌菌菌接接
47、接接种种种种于于于于寄寄寄寄主主主主植植植植物物物物或或或或过过过过敏敏敏敏性性性性发发发发应应应应植植植植物物物物，观观观观察察察察所所所所得得得得症症症症状状状状，从从从从而而而而完完完完成成成成柯柯柯柯赫赫赫赫氏氏氏氏法法法法则则则则的诊断程序。的诊断程序。的诊断程序。的诊断程序。四、链霉素防治四、链霉素防治 植植物物病病原原细细菌菌对对链链霉霉素素敏敏感感，可用于防治细菌病害。可用于防治细菌病害。三三、植物病原细菌的主要类群植物病原细菌的主要类群及分类地位及分类地位五界生物分类系统，细菌属于原核生物界。五界生物分类系统，细菌属于原核生物界。参考：参考：伯杰氏系统细菌手册伯杰氏系统细菌手
48、册四、主要属四、主要属 长期以来，植物病原细菌仅限于长期以来，植物病原细菌仅限于长期以来，植物病原细菌仅限于长期以来，植物病原细菌仅限于5 5 5 5个属：个属：个属：个属：土壤杆菌属土壤杆菌属土壤杆菌属土壤杆菌属（AgrobacteriumAgrobacterium）欧氏杆菌属欧氏杆菌属欧氏杆菌属欧氏杆菌属（ErwiniaErwinia）假单胞杆菌属假单胞杆菌属假单胞杆菌属假单胞杆菌属（PseudomonasPseudomonas）黄单胞杆菌属黄单胞杆菌属黄单胞杆菌属黄单胞杆菌属（XanthomonasXanthomonas）棒形杆菌属棒形杆菌属棒形杆菌属棒形杆菌属（ClavibacterC
49、lavibacter）五属细菌分类检索表五属细菌分类检索表A A A A.革兰氏染色阳性，一般不能游动革兰氏染色阳性，一般不能游动革兰氏染色阳性，一般不能游动革兰氏染色阳性，一般不能游动棒形杆菌属棒形杆菌属棒形杆菌属棒形杆菌属（ClavibacterClavibacter）AAAAAAAA.革兰氏染色阴性，能游动。革兰氏染色阴性，能游动。革兰氏染色阴性，能游动。革兰氏染色阴性，能游动。B.B.B.B.鞭毛极生鞭毛极生鞭毛极生鞭毛极生 C C C C.鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或蓝绿色色素鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或蓝绿色色素鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或
50、蓝绿色色素鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或蓝绿色色素假单胞杆假单胞杆假单胞杆假单胞杆菌属菌属菌属菌属（PseudomonasPseudomonas）CC.CC.CC.CC.鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素黄假胞杆菌属黄假胞杆菌属黄假胞杆菌属黄假胞杆菌属（XanthomonasXanthomonas）BB.BB.BB.BB.鞭毛周生鞭毛周生鞭毛周生鞭毛周生 C C C C.鞭毛鞭毛鞭毛鞭毛1 1 1 1 4 4 4 4条，引起肿瘤条，引起肿瘤条，引起肿瘤条，引