植物病原细菌研究方法.pptx

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1、内容提纲：细菌的基本形态特征常规细菌生理生化检测方法细菌种类鉴定方法植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法有益细菌的利用研究第1页/共115页细菌的基本形态特征细菌的基本形态特征 细菌细菌（bacteriabacteria）是单细胞原核微生物，）是单细胞原核微生物，个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。个体微小，形态简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。在自然界中，细菌分布最广、数量最多。第2页/共115页细菌的形态和大小细菌的形态和大小细菌的细胞结构细菌的细胞结构细菌的繁殖与群体形态细菌的繁殖与群体形态第3页/共115页（一）细菌的大小细菌大小的测定：细菌大小的测定：(

2、1)测量：测量：测微尺测微尺(2)长度单位：长度单位：微米微米(m)(3)表示：表示：球菌：球菌：直径直径 杆菌：杆菌：宽宽长长 螺菌：螺菌：宽、长、螺距宽、长、螺距第4页/共115页第5页/共115页 通常通常球菌直径球菌直径：0.2 0.2 1.51.5 mm，杆菌杆菌:长长1 1 5 m,5 m,宽宽0.50.5 1 m 1 m。例如：例如：大肠杆菌：平均长度：大肠杆菌：平均长度：2 m 2 m；宽度宽度0 0.5.5mm 15001500个大肠杆菌头尾相接等于个大肠杆菌头尾相接等于3 3mm;mm;10 109 9个大肠杆菌重个大肠杆菌重1 1 mg.mg.由于菌种由于菌种不同不同，细

3、菌的大小存在很大的差异；对于同，细菌的大小存在很大的差异；对于同一个菌种，细胞的大小也常随着菌龄变化。另外，对于同一个菌种，细胞的大小也常随着菌龄变化。另外，对于同一个菌种染色前后其细胞大小都有所不同。所以，有关细一个菌种染色前后其细胞大小都有所不同。所以，有关细菌大小的记载，常是平均值或代表性数值。菌大小的记载，常是平均值或代表性数值。第6页/共115页 菌名菌名菌名菌名 直径或宽直径或宽直径或宽直径或宽长长长长 （m m m m）乳链球菌乳链球菌乳链球菌乳链球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽

4、孢杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌霍乱弧菌 0.5 0.5 1 1 0.8 0.8 1 1 0.5 (1 0.5 (1 3)3)(0.8 (0.8 1.2)(1.2)(1.21.2 3 3)(0.2 (0.2 0.6)0.6)(1(1 3 3)细菌细胞的大小细菌细胞的大小第7页/共115页（二）、细菌的形态 不不同同细细菌菌的的形形态态可可以以说说是是千千差差万万别别，丰丰富富多多彩彩，但但就就单单个个有有机机体体而而言言，其其基基本本形形态态可可分分为为球球状状、杆杆状状与与螺螺旋状旋状三种三种.除除了了球球菌菌、杆杆菌菌、蛆蛆旋旋菌菌三三种种基基本本形形态态外外，还还有有许许多多具具其其他他形

5、形态态的的细细菌菌。例例如如柄柄杆杆菌菌细细胞胞上上有有柄柄、菌菌丝丝、附附器器等等细细胞胞质质伸伸出出物物，细细胞胞呈呈杆杆状状或或梭梭状状，并并有有特特征征性性的的细细柄柄；球球衣衣菌菌能能形形成成衣衣峭峭，杆杆状状的的细细胞胞呈呈链链状状排排列列在在衣衣鞘鞘内内而而成成为为丝丝状状,而而支支原原体体由由于于只只有有细细胞胞膜膜，没没有有纫纫胞胞壁壁，故故细细胞胞柔柔软软，形形态态多多变变，具具有有高高度度多多形形性性。另另外外，人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌。人们还发现了细胞呈星形和方形的细菌。第8页/共115页 球状、杆状和螺旋状球状、杆状和螺旋状细菌的三种基本形态细菌的三种基本形

6、态:第9页/共115页1.球 菌单球菌单球菌双球菌双球菌链球菌链球菌四联球菌四联球菌八叠球菌八叠球菌 葡萄球菌葡萄球菌第10页/共115页2.2.杆菌杆菌 杆菌是细菌中种类最多的类型杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。杆菌的形态：杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、短杆状、长杆状、棒杆状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等；按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、按杆菌细胞的排列方式则有链状、栅状、“八八”字状以及有鞘衣的丝状等。字状以及有鞘衣的丝状等。第11页/共115页

7、2.2.杆杆 菌菌短杆菌长杆菌梭状芽孢杆菌第12页/共115页链状杆菌单杆菌2.2.杆杆 菌菌第13页/共115页杆菌细胞两端的形态特征杆菌细胞两端的形态特征2.2.杆杆 菌菌第14页/共115页3 3、螺旋菌、螺旋菌螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为螺旋菌。螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：根据其弯曲情况分为：弧菌：弧菌：弧菌：弧菌：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌例：霍乱弧菌、逗号弧菌例：霍乱

8、弧菌、逗号弧菌例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌：螺旋菌：螺旋菌：螺旋菌：螺旋满螺旋满螺旋满螺旋满2 2 2 26 6 6 6环，螺旋状环，螺旋状环，螺旋状环，螺旋状 例：干酪螺菌例：干酪螺菌例：干酪螺菌例：干酪螺菌 螺旋体：螺旋体：螺旋体：螺旋体：旋转周数在旋转周数在旋转周数在旋转周数在6 6 6 6环以上，菌体柔软。环以上，菌体柔软。环以上，菌体柔软。环以上，菌体柔软。例：梅毒密螺旋体例：梅毒密螺旋体例：梅毒密螺旋体例：梅毒密螺旋体第15页/共115页螺旋菌弧菌螺旋体3 3、螺旋菌、螺旋菌第16页/共115页 细菌的特殊形态：细菌的特殊形态：柄细菌、肾形菌、臂微菌、网格硫细柄细菌、肾形菌、臂微菌

9、、网格硫细 菌、贝日阿托氏菌菌、贝日阿托氏菌(丝状丝状)、具有子实体的粘、具有子实体的粘细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。细菌、三角形、方形等特殊形态的细菌。第17页/共115页细菌的特殊形态细菌的特殊形态第18页/共115页二、细菌的细胞结构二、细菌的细胞结构u基本结构包括：基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、间体、核糖体、气泡和储藏物。间体、核糖体、气泡和储藏物。u特殊结构包括：特殊结构包括：荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。荚膜、鞭毛、纤毛、芽孢。第19页/共115页细菌细胞结构细菌细胞结构第20页/共115页1.1.固体斜面培养固体斜面培养 2.2.液体培

10、养基液体培养基 3.3.半固体培养半固体培养第21页/共115页植物病原细菌概述植物病原细菌概述 绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为绝大多数为好气性细菌；生长温度大多为25-25-2828，少数可以，少数可以2020或在或在3535中（如青枯菌）中（如青枯菌）生长。生长。植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温植物病原细菌都不产生芽孢，因此对高温比较敏感，一般在比较敏感，一般在5050左右的热水中处理左右的热水中处理1010分分钟即失活，适宜的钟即失活，适宜的pHpH为为6-76-7。第22页/共115页植物病原细菌的革兰氏染色（细菌的革兰氏染色反应是细菌分类鉴定的一个重要特征）常规细菌生理生化

11、检测方法常规细菌生理生化检测方法第23页/共115页细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构v革兰氏革兰氏阳性阳性菌细胞壁：菌细胞壁：由肽聚糖和磷壁酸组成由肽聚糖和磷壁酸组成 磷壁酸：磷壁酸：磷壁酸：磷壁酸：占占40%40%。G G+菌菌所特有所特有,其主链由数十个其主链由数十个磷酸甘油或磷酸核糖醇磷酸甘油或磷酸核糖醇组成组成,有的还有由有的还有由D DAlaAla和还原糖组成的侧链。和还原糖组成的侧链。肽聚糖肽聚糖:占3070%,不同菌种中肽聚糖(肽链)组分不同。第24页/共115页v革兰氏革兰氏阴性阴性菌细胞壁：菌细胞壁：分内壁层和外壁层。分内壁层和外壁层。内壁层：内壁层：紧贴胞膜,仅由12层肽聚

12、糖分子构成,占细胞壁干重5-10%,无磷壁酸。外壁层：外壁层：位于肽聚糖层的外部。脂多糖;脂蛋白、包括:蛋白质层:基质蛋白、外壁蛋白;磷脂.第25页/共115页v革兰氏染色的原理革兰氏染色的原理第26页/共115页v革兰氏染色原理：革兰氏染色原理：第一步：第一步：结晶紫使菌体着上紫色；结晶紫使菌体着上紫色；第二步：第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内；壁阻留在细胞内；第三步：第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应；应；G G+菌：菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联

13、度大，当乙醇脱色时，细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色；GG菌：菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。呈红色。第27页/共115页 革兰氏染色法

14、是细菌细胞的复合染色法，由丹革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生麦医生Hans Christian GramHans Christian Gram于于18841884年年创立创立。基本步骤：基本步骤：涂片固定涂片固定 结晶紫初染结晶紫初染1min1min 碘液媒染碘液媒染1min1min95%95%乙醇脱色乙醇脱色0.5min0.5min 番红复染番红复染minmin 结果结果:革兰氏革兰氏阳性菌阳性菌紫色紫色；革兰氏革兰氏阴性菌阴性菌红色红色。革兰氏染色法：革兰氏染色法：第28页/共115页实验材料 待测细菌 枯草芽孢杆菌（G+）甘蓝黑腐病菌（G-）染液：结晶紫草酸铵染剂、鲁戈尔碘

15、液、复染剂（番红O）用具：移植饵、清洁无脂载玻片第29页/共115页清洁无脂载玻片阳性对照菌（紫色或蓝黑色）待 测 菌阴性对照菌（红色）示范图对照菌呈现正确颜色，实验才为成功第30页/共115页涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色1min水洗、吸干镜检镜检简单染色简单染色制备涂片标本制备涂片标本染色染色第31页/共115页阳性菌阳性菌阴性菌阴性菌革兰氏染色法革兰氏染色法第32页/共115页革兰氏染色阴性革兰氏染色阴性大肠杆菌大肠杆菌第33页/共115页革兰氏染色阳性革兰氏染色阳性枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌第34页/共115页 注：（1）、实验细菌为活跃生长期的培养物；（2）、菌液不能太浓，涂片不宜过

16、厚，造成假阳性；（3）、火焰固定涂片，以载玻片不烫手为宜；（4）、脱色时间把握好，过长，假阴性；过短，假阳性。第35页/共115页鞭毛：鞭毛：某些细菌表面由细胞内生出的细长、波曲、某些细菌表面由细胞内生出的细长、波曲、毛发状的结构。毛发状的结构。鞭毛具有运动功能，一般认为鞭毛靠鞭毛丝旋转而鞭毛具有运动功能，一般认为鞭毛靠鞭毛丝旋转而动，动，它们是细菌的它们是细菌的“运动器官运动器官”。鞭毛的长度：鞭毛的长度：一般为一般为151520 20 m m，最长可达，最长可达70 70 m m。鞭毛的直径：鞭毛的直径：为为0.010.010.02 0.02 m.m.不同细菌的鞭毛数目和着生位置不同，鞭毛

17、数目一不同细菌的鞭毛数目和着生位置不同，鞭毛数目一般一至数十条。般一至数十条。细菌鞭毛染色第36页/共115页鞭毛的着生方式：鞭毛的着生方式：周生周生第37页/共115页鞭毛的化学组成：鞭毛的化学组成：主要由鞭毛蛋白构成，还含有少量的多糖、主要由鞭毛蛋白构成，还含有少量的多糖、脂类和核酸等。脂类和核酸等。鞭毛起源于细胞质膜内侧的基粒。鞭毛起源于细胞质膜内侧的基粒。细胞质区内有一个颗粒状小体，此小体为细胞质区内有一个颗粒状小体，此小体为基粒，鞭毛自基粒长出穿过细胞壁延伸到细胞基粒，鞭毛自基粒长出穿过细胞壁延伸到细胞外部。外部。第38页/共115页 鞭毛的结构：鞭毛的结构：鞭毛丝鞭毛丝鞭毛鞭毛 鞭

18、毛钩鞭毛钩 基体基体第39页/共115页鞭毛的观察：鞭毛的观察：电镜电镜特殊鞭毛染色，在光学显微镜下观察特殊鞭毛染色，在光学显微镜下观察半固体穿刺培养半固体穿刺培养从固体培养基上的菌落形态判断从固体培养基上的菌落形态判断一般情况下：一般情况下：菌落形状大，薄且不规则，边缘极不平整，可能有鞭毛。菌落形状大，薄且不规则，边缘极不平整，可能有鞭毛。菌落十分圆滑，边缘平整且相对较厚，可能没有鞭毛。菌落十分圆滑，边缘平整且相对较厚，可能没有鞭毛。第40页/共115页 实验菌种及药品实验菌种及药品 1菌种：菌种：枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 2染液染液 染液染液A：单宁酸单宁酸 5.0g 氯化铁（氯化铁（Fe

19、cl36H2O）1.5g 福尔马林（福尔马林（15）2.0ml（15%福尔马林：福尔马林：40%甲醛甲醛4ml+蒸馏水蒸馏水6ml）NaOH(1%)1.0ml 蒸馏水蒸馏水 100ml 染液染液B：硝酸银硝酸银 2g 蒸馏水蒸馏水 100ml第41页/共115页三、染色方法：三、染色方法：银盐染色法银盐染色法 硝酸银溶于蒸馏水中。取10ml作回滴用，向其余90ml硝酸银溶液中逐滴加浓氢氧化铵，先形成很浓的沉淀，再继续滴加浓氢氧化铵至沉淀消失为止。然后慢慢滴入备用的硝酸银溶液则出现少量雾状沉淀，但轻轻摇动后，沉淀又消失，再滴入硝酸银溶液，直到摇动后雾状沉淀不再消失为止。此液不耐保存，4小时内染色

20、效果最佳。第42页/共115页菌体鞭毛第44页/共115页菌体鞭毛第45页/共115页第46页/共115页菌体鞭毛第47页/共115页芽孢芽孢 概念：概念：某些菌生长到一某些菌生长到一定阶段，细胞内形成一定阶段，细胞内形成一个圆形、椭圆形或卵圆个圆形、椭圆形或卵圆形的内生孢子，是对不形的内生孢子，是对不良环境有较强抵抗力的良环境有较强抵抗力的休眠体。休眠体。芽芽孢孢第48页/共115页能形成芽孢的细菌种类：能形成芽孢的细菌种类：在杆菌中能形成芽孢的种类在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢。产生芽孢的几个属：产生芽孢的

21、几个属：芽孢杆菌属芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属梭状芽孢杆菌属芽孢乳杆菌属芽孢乳杆菌属生孢八叠球菌属（其中的一个种）生孢八叠球菌属（其中的一个种）第49页/共115页芽孢芽孢的形态及其的形态及其在细胞中的位置：在细胞中的位置：A A 近中央近中央 B B 末端末端 C C 中央中央第50页/共115页 细菌芽孢的各种类型细菌芽孢的各种类型第51页/共115页芽孢的组成和结构芽孢的组成和结构 芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心芽孢有多层结构，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮层和核心.芽孢的结构芽孢的结构芽孢的外壁层厚而致密，主要成芽孢的外壁层厚而致密，主要成分为脂蛋白，通透性差分为脂蛋白，通

22、透性差,不易着色。不易着色。核心含有大量的核心含有大量的DNADNA、RNARNA、蛋白蛋白质酶等物质，还含有质酶等物质，还含有2,62,6吡啶二吡啶二羧酸羧酸（DPADPA）,DPA,DPA是芽孢特有的成是芽孢特有的成分。一般以分。一般以 DPADPACaCa的形式存在的形式存在。皮层主要含芽孢肽聚糖、皮层主要含芽孢肽聚糖、DPADPACaCa，皮层体积大，比较致密。皮层体积大，比较致密。芽孢平均含水量低芽孢平均含水量低,约约40%.40%.第52页/共115页芽孢的特性芽孢的特性:具有很强的具有很强的抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。抗热、抗干燥、抗辐射、抗化学药物能力。含水量低、壁厚

23、而致密，通透性差含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易着色。不易着色。新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。新陈代谢几乎停止，处于休眠状态。一个芽孢萌发产生一个个体。一个芽孢萌发产生一个个体。芽孢的抗热机制：芽孢的抗热机制：目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、目前尚不清楚，但可能与以下因素有关，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比较耐热。第53页/共115页芽孢染色芽孢染色（孔雀绿藏红染色）染剂染剂 孔雀绿水溶液孔雀绿水溶液 5 染剂染剂 藏红水溶液藏红水溶液 0.5 或或 碱性品红水溶液碱性品红水溶液 0.05染色方法：染色方法：1、涂

24、片固定；、涂片固定；2、加染剂、加染剂在酒精灯火焰上加热染色在酒精灯火焰上加热染色1min，勿使染液沸腾和干燥；，勿使染液沸腾和干燥；3、水洗；、水洗；4、染剂、染剂染色染色15s；5、水洗，风干后镜检。菌体染成红色，芽孢染成绿色。、水洗，风干后镜检。菌体染成红色，芽孢染成绿色。第54页/共115页芽孢菌体第55页/共115页常规鉴定方法全自动微生物鉴定仪-Biolog 植物病原细菌的鉴定方法植物病原细菌的鉴定方法第56页/共115页菌落特征比较菌落特征比较 常规细菌鉴定方法参考：参考：东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，东秀珠等，常见细菌系统鉴定手册，科学出版社，2001第57页/共

25、115页第58页/共115页全自动微生物鉴定仪-Biolog鉴定原理 BiologBiolog公司独创的公司独创的碳源碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选异，针对每一类微生物筛选9595种不同碳源，配合四唑类显色物质（如种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTCTTC、TVTV），固定于），固定于9696孔板上（孔板上（A1A1孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原

26、酶氧化还原酶与显色物质发生反应与显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），成的浊度差异（浊度），与标准菌株数据库进行比对与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定，即可得出最终鉴定结果。结果。第59页/共115页第60页/共115页主要特点 快速读取结果 鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件将该吸光值与数据库对比，就可在瞬时给出鉴定结果。试验结果可由系统进行自动分析、记录和打印。强大的数据库 Biolog微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内总计1973种微生物，几乎涵盖了

27、所有的人类、动物、植物病原菌以及食品和环境微生物。第61页/共115页BIOLOG在植物病原菌鉴定方面 可鉴定常见的可鉴定常见的假单胞菌假单胞菌(PseudomonasPseudomonas,77,77种种)、伯伯克霍尔德菌克霍尔德菌(BurkholderiaBurkholderia)、黄单孢菌属黄单孢菌属(XanthomonasXanthomonas)、果胶杆菌属果胶杆菌属(PectobacteriumPectobacterium)、食食酸菌属酸菌属(AcidovoraxAcidovorax)、根瘤菌属根瘤菌属(RhizobiumRhizobium)等近等近200200种植物致病菌，特别适合

28、各农业大学、研究所及相关种植物致病菌，特别适合各农业大学、研究所及相关机构进行植物病理分析和研究用。机构进行植物病理分析和研究用。第62页/共115页BIOLOGBIOLOG在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，在食品工业应用及研究领域提供大量的数据库，包括包括7070多种乳酸菌多种乳酸菌、3030多种双歧杆菌多种双歧杆菌及各类常见的食及各类常见的食品必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、品必检的致病菌数据库，包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌大肠杆菌(含阪崎肠杆菌含阪崎肠杆菌)、葡萄球菌、弯曲菌、假单、葡萄球菌、弯曲菌、假单胞菌、弧菌、梭菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及胞菌、弧菌、梭

29、菌、志贺氏菌等，用于食品、药品及化妆品行业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研化妆品行业用于致病微生物鉴定、工业应用微生物研究、质量控制及产品研发等。究、质量控制及产品研发等。第63页/共115页BIOLOG专门分开提供一个专门分开提供一个DP(危险微生物危险微生物)数据库，数据库，包含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏包含鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、马尔他布鲁氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌(鼻疽假单鼻疽假单孢菌孢菌)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、苏云金芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌等结核耶

30、尔森氏菌、蜡样芽胞杆菌等12种强致病微生物，种强致病微生物，适用于国家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构适用于国家疾病控制中心、国家安全机构及军事机构用于生物武器检测及防治研究。用于生物武器检测及防治研究。目前广泛用于美国军目前广泛用于美国军方进行生物恐怖检测及预防研究。方进行生物恐怖检测及预防研究。第64页/共115页鉴定初始首先按常规微生物操作方法分离出纯种。第65页/共115页n n鉴定步骤如下：第一步第一步用用BiologBiolog专用培养基将纯种扩大培养。专用培养基将纯种扩大培养。第二步第二步按要求配制一定浊度按要求配制一定浊度(细胞浓度细胞浓度)的菌悬液。的菌悬液。第三步第三步

31、将菌悬液接种至微孔鉴定板将菌悬液接种至微孔鉴定板(Microplate)(Microplate)，培养一定时间。，培养一定时间。第四步第四步 将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。第66页/共115页第67页/共115页第68页/共115页第69页/共115页植物病原细菌检测和细菌病害植物病原细菌检测和细菌病害诊断方法诊断方法第70页/共115页一、症状特征一、症状特征第71页/共115页第72页/共115页第73页/共115页第74页/共115页十字花科软腐病十字花科软腐病第75页/共115页瓜萎蔫病第76页/共115

32、页肿瘤肿瘤第77页/共115页 由由细细菌菌侵侵染染所所致致病病害害的的病病部部，无无论论是是维维管管束束系系统统受受害害的的，还还是是薄薄壁壁组组织织受受害害的的，都都可可以以在在徒徒手手切切片片中中看看到到有有大大量量细细菌菌从从病病部部喷喷出出，这这种种现现象象称称为为菌菌溢溢现现象象(bacteria exudation，BE)。菌菌溢溢现现象象为为细细菌菌病病害害特特有有，是是区区分分细细菌菌病病害害或或真真菌菌、病病毒毒病病害害的的最最简简便便的的手手段段之一。之一。二、显微镜检查二、显微镜检查 （菌溢现象）（菌溢现象）第78页/共115页菌溢现象操作方法菌溢现象操作方法细菌病害的

33、病组织，内含有大量菌体，可通过菌细菌病害的病组织，内含有大量菌体，可通过菌溢现象或诊断，具体方法：溢现象或诊断，具体方法：取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。取病健组织交界部位一小块，置于截玻片上。加一滴无菌水后，加盖玻片。加一滴无菌水后，加盖玻片。低倍镜下，暗光，观察。低倍镜下，暗光，观察。可看到病斑切口处有大量细菌云雾状涌出。可看到病斑切口处有大量细菌云雾状涌出。第79页/共115页菌溢现象菌溢现象 第80页/共115页第81页/共115页1、凝集反应、凝集反应v 颗粒性抗原如细菌与其特异性抗体在电解质影响下，很快结合成可见的凝集块。载玻片凝集反应是最快速的测定方法：在清洁载玻片上加两

34、滴生理盐水配的菌悬液，用移植环取少量抗血清与其中一滴菌悬液混合，另一滴不加血清作为对照。经35分钟，可以看到原来均匀悬浮的细菌凝集成团，对照则不发生这种变化。另一种常用方法是试管凝集反应，虽然没有玻片凝集反应快捷，但能测定血清效价和作定量研究。分子生物学检测技术分子生物学检测技术 第82页/共115页2、酶联免疫吸附法、酶联免疫吸附法 （Enzyme linked immune sorbent assay,ELISA）v 该方法是将微量的酶与测定的抗原或抗体结合，大大的提高抗原和抗体反应的灵敏度。抗体夹心ELISA法通常比其他ELISA方法敏感25倍。先用抗体包被聚苯乙烯微量滴定板孔，然后加测

35、定抗原样本，抗原被抗体吸附，然后将酶联抗体加在被吸附的抗原上。最后再加酶的底物，酶催化底物而显色，用分光光度计检测。第83页/共115页第84页/共115页第85页/共115页第86页/共115页4 4、核酸杂交及PCR诊断技术第87页/共115页v 利用核酸链间碱基配对核酸杂交来识别特定核酸顺序的方法。将一个预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段，加以标记，就成为核酸探针(probe)(probe)。用核酸探针可以探测待查标本核酸中与探针具有互补的碱基顺序。如果两者有互补顺序则杂交成功,结果阳性;若待查标本核酸与探针顺序无关则杂交失败,结果呈阴性。由于大多数植物病毒的核酸是RNA,RNA,其探

36、针为互补DNA DNA(complementary DNA,cDNA)(complementary DNA,cDNA)，称为cDNAcDNA探针。4.1 核酸杂交核酸杂交 第88页/共115页核酸杂交核酸杂交 第89页/共115页4.2 PCR诊断技术诊断技术聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）是一种体外扩增特异性DNA的技术，在短时间内可以大量扩增核酸。整个扩增包括3 3个重复的步骤：（1 1）DNADNA热变性，双链变单链；（2 2）引物退火，当温度降低时，两个引物分别结合到靶DNADNA的两条链的33末端，（3 3）引物延伸，在DNADNA聚合酶的

37、催化下，引物由5533扩增延长。分别和相对的DNADNA链互补。第90页/共115页第91页/共115页第92页/共115页Real-time fluorescent PCRREP-PCRImmuno-PCRRAPD-PCRNested-PCR 在植物病原细菌检测和鉴定中应用的在植物病原细菌检测和鉴定中应用的PCR技术技术第93页/共115页 三、分离培养与致病性测定三、分离培养与致病性测定 培培养养基基稀稀释释法法或或划划线线法法培培养养。观观察察单单个个菌菌落特点。落特点。将将分分离离的的细细菌菌接接种种于于寄寄主主植植物物或或过过敏敏性性发发应应植植物物，观观察察所所得得症症状状，从从而

38、而完完成成柯柯赫赫氏氏法则法则的诊断程序。的诊断程序。第94页/共115页四、链霉素防治四、链霉素防治 植植物物病病原原细细菌菌对对链链霉霉素素敏敏感感，可用于防治细菌病害。可用于防治细菌病害。第95页/共115页三三、植物病原细菌的主要类群植物病原细菌的主要类群及分类地位及分类地位五界生物分类系统，细菌属于原核生物界。五界生物分类系统，细菌属于原核生物界。参考：参考：伯杰氏系统细菌手册伯杰氏系统细菌手册第96页/共115页第97页/共115页四、主要属四、主要属 长期以来，植物病原细菌仅限于长期以来，植物病原细菌仅限于5 5个属：个属：土壤杆菌属土壤杆菌属（Agrobacterium）欧氏杆

39、菌属欧氏杆菌属（Erwinia）假单胞杆菌属假单胞杆菌属（Pseudomonas）黄单胞杆菌属黄单胞杆菌属（Xanthomonas）棒形杆菌属棒形杆菌属（Clavibacter）第98页/共115页五属细菌分类检索表五属细菌分类检索表A A.革兰氏染色阳性，一般不能游动革兰氏染色阳性，一般不能游动棒形杆菌属棒形杆菌属（Clavibacter）AAAA.革兰氏染色阴性，能游动。革兰氏染色阴性，能游动。B.B.鞭毛极生鞭毛极生 C C.鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或蓝绿色色素鞭毛一般多条，在培养基上产生水溶性黄绿色或蓝绿色色素假假单胞杆菌属单胞杆菌属（Pseudomonas）CC.CC

40、.鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素鞭毛一般单条，在培养基上产生非水溶性色素黄假胞杆菌属黄假胞杆菌属（Xanthomonas）BB.BB.鞭毛周生鞭毛周生 C C.鞭毛鞭毛1 14 4条，引起肿瘤条，引起肿瘤土壤杆菌属土壤杆菌属（Agrobacterium）CC.CC.鞭毛多条，引致腐烂或萎蔫鞭毛多条，引致腐烂或萎蔫欧氏杆菌属欧氏杆菌属（Erwinia）第99页/共115页供试菌株革兰氏反应阳性杆菌或球菌形成丝状细胞Streptomyces（链霉菌属）形成芽孢36生长，在7NaCl中生长Curtobacterium短小杆菌属尿酶Rhodococcus红球菌属Clavibacter棒形杆菌

41、属革兰氏反应阴性不形成芽孢Bacillus芽孢杆菌属；Clostridium梭状芽孢杆菌属+-+-植物病原细菌主要属简要检查方法第100页/共115页好氧性或不活泼性滑行运动，在琼脂平板上铺开生长，短或长杆形弯曲、氧化酶阳性以鞭毛游动在KingsB培养基上产生荧光色素发酵性Cytophaga噬胞菌属；Flexibacter屈桡杆菌属+-革兰氏反应阴性不运动，菌落光滑短杆状、氧化酶阴性Flavobacterium黄杆菌属溶果胶活性+-Erwinia（软腐组群）Erwinia（不溶果胶组群）Pseudomonas（无荧光组群）在1葡萄糖营养琼脂上为白色菌落，周鞭，致瘤Agrobacterium土壤

42、杆菌属Xanthomonas黄单胞菌属在1葡萄糖营养琼脂上为黄色菌落，单极鞭Pseudomonas（荧光组群）第101页/共115页有益细菌的利用研究有益细菌的利用研究第102页/共115页u生物防治 利用其他对植物无害的生物来影响或抑制病原物的生存和活动，从而降低病害的发生率或严重度。（1）抗菌作用(antibiosis)（2）溶菌作用(lysis)（3）竞争作用(competition)（4）重寄生作用(hyperparasitism)（5）捕食作用（predation）（6）交互保护作用(cross protection)第103页/共115页Sir Alexander Fleming

43、discovered the antibiotic penicillin.He had the insight to recognize the significance of the inhibition of bacterial growth in the vicinity of a fungal contaminant when most other scientists probably would have simply discarded the contaminated plates.Alexander Fleming(1881-1955)亚历山大弗莱明英国细菌学家 葡萄球菌 青

44、霉菌 第104页/共115页 19281928年的一天，弗莱明在他的一间简陋的实验室里研究导致人体发热的葡萄年的一天，弗莱明在他的一间简陋的实验室里研究导致人体发热的葡萄球菌。由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的琼脂上附了一层青霉菌。这是从球菌。由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的琼脂上附了一层青霉菌。这是从楼上的一位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来的。使弗莱明感到惊讶的是，在青楼上的一位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来的。使弗莱明感到惊讶的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深深吸引了他，他设法培养霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深深吸引了他，他设法培养这种霉菌进

45、行多次试验，证明青霉素可以在几小时内将葡萄球菌全部杀死。弗莱这种霉菌进行多次试验，证明青霉素可以在几小时内将葡萄球菌全部杀死。弗莱明据此发明了葡萄球菌的克星明据此发明了葡萄球菌的克星青霉素。青霉素。由于青霉素的发现和大量生产，拯救了千百万肺炎、脑膜炎、脓肿、败血症由于青霉素的发现和大量生产，拯救了千百万肺炎、脑膜炎、脓肿、败血症患者的生命，及时抢救了许多的伤病员。青霉素的出现，当时曾轰动世界。患者的生命，及时抢救了许多的伤病员。青霉素的出现，当时曾轰动世界。为了表彰这一造福人类的贡献，弗莱明、钱恩、弗罗里于为了表彰这一造福人类的贡献，弗莱明、钱恩、弗罗里于19451945年共同获得诺年共同获得

46、诺贝尔医学和生理学奖。贝尔医学和生理学奖。青霉素的发现者英国细菌学家弗莱明第105页/共115页图中央是青霉菌，周围是致病细菌。距青霉素最远的细菌个大、色浓，活力十足；距青霉菌较近的细菌个较小、色较浅，活力较差；而最接近青霉菌的细菌个最小、色发白，显然已经死亡 葡萄球菌这些形如珍珠的东西就是危害人体健康的葡萄菌，青霉素能消灭它们。第106页/共115页与弗莱明共同获得1945年诺贝尔生理学和医学奖。1940提纯出青霉素澳大利亚病理学家霍华德.弗罗里第107页/共115页第108页/共115页第109页/共115页植物病害的生物防治中的应用第110页/共115页 平板拮抗测试平板拮抗测试待测细菌待测细菌病原真菌病原真菌注：病原真菌和待测细菌同时接种注：病原真菌和待测细菌同时接种第111页/共115页第112页/共115页拮抗菌对病原菌的抑制作用拮抗菌对病原菌的抑制作用正常菌丝畸形菌丝第113页/共115页第114页/共115页感谢您的观看！第115页/共115页