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1、生命科学学院生命科学学院遗传学遗传学 冯冯 刚刚抗体抗体(antibodyantibody)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibodymonoclonal antibody)是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。特点特点：1.高特异性；2.高均一性；3.高单一性。1.定义：定义：1975年，淋巴细胞杂交瘤技术由Kohler和Milstein建立。致敏致敏B淋巴细胞淋巴细胞(sensitized B cells)(能够分泌特异性的抗体能够分泌特异性的抗体，不，不能在体外长期生存能在
2、体外长期生存)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞(myeloma)(不能分泌特异性的抗体，但能在体外不能分泌特异性的抗体，但能在体外长期生存长期生存)12阳性杂交瘤细胞阳性杂交瘤细胞(hybridoma)克隆化培养克隆化培养（产生单克隆的阳性（产生单克隆的阳性杂交瘤细胞杂交瘤细胞）21222单克隆抗体单克隆抗体2.单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体制备的基本原理1生产单抗生产单抗3.单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程4.研究进展研究进展4.1鼠源性抗体鼠源性抗体主要步骤包括：主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等。不足：不足：鼠源性抗体作为异种
3、蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)，这在很大程度上限制了mAbs的临床应用。此外，鼠源性的mAbs不能与人类抗体FcRn结合。技术：技术：B淋巴细胞杂交瘤技术。4.24.2人源化抗体人源化抗体4.2.1嵌合抗体嵌合抗体指的是鼠mAbs的恒定区基因被人Abs的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码产生的单克隆抗体。这样既能保持鼠单抗的特性，又使获得的单抗降低了在人体内的免疫反应。4.2.2CDR移植抗体，又称改型抗体，移植抗体，又称改型抗体，是在嵌合抗体的基础上，利用基因工程技术，进一步用人的FR代替鼠FR，形成的只剩3个
4、鼠源CDR的、更为完全的人源化抗体。主要包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体。不足：由于具有支持作用的FR不仅为CDR的构象提供了环境，还参与抗体结合位点正确构象的形成和抗原的结合，常常使得CDR移植抗体的亲和力和特异性大大降低，有的甚至还丧失了抗原结合能力。解决方案解决方案：选用与鼠源单抗具有高度同源性的人源抗体，但保留鼠源单抗中的一些关键氨基酸残基，并在此基础上，对鼠CDR和FR的一些表面氨基酸残基进行修饰或重塑，对关键氨基酸残基进行一定的改变，能在保留CDR移植抗体的亲和力和特异性下，大大降低其免疫原性。优点：优点：人源化程度能达到70%以上，有利于其在临床试验中的应用与研究。4.2.3
5、全人源化抗体制备方法：噬菌体展示技术和转基因小鼠技术。(1)噬菌体展示技术基本原理：将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因通过基因工程技术随机插入噬菌体的外壳蛋白基因，继而感染大肠杆菌，经增殖并以抗体片段Fab或ScFv外壳蛋白融合蛋白的形式展示在噬菌体表面；利用靶分子，经过“亲和-洗脱-扩增-亲和”循环过程筛选，除去杂蛋白并富集特异性抗体。特点：实现了直接将基因型和表现型完美的结合在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体。存在的问题：(1)抗体亲和力相对较弱;(2)抗体多样性无法满足。目前已建立的噬菌体展示系统，如：丝状噬菌体、l噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体和真
6、核病毒系统等。(2)转基因小鼠技术该技术至今还未发展完全，其转基因片段较小，且相邻基因片段高度同源，重组过程复杂，在面对抗原多样性时，无法完全产生相应的抗体。4.3核糖体展示技术基本原理：基本原理：利用PCR扩增含目的基因的cDNA文库，再加上启动子、核糖体结合位点及茎环结构，在转录/翻译偶联系统作用下，形成“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物，用相应抗原反复筛选复合物，分离mRNA，通过RT-PCR富集目的基因，并将目的基因导入表达载体，从而获得库容量大、特异性强、亲和力高的人源基因工程抗体库。存在的问题：存在的问题：1.mRNA易降解。2.“蛋白质-核糖体-mRNA”三元复合物的稳定性也
7、较差。解决方案：解决方案：1.目前已有研究表明，氧钒核糖核苷复合物(VRC)作为过渡阶段的类似物发生作用，可有效地抑制核酸酶，提高mRNA的稳定性。2.在缓冲液中加入一定浓度的镁离子、交联核糖体RNA的磷酸基团，可抑制核糖体复合物的解离。1.与噬菌体展示技术和转基因技术相比，由于其完全属于体外操作系统，无需依赖细胞技术和毒性蛋白对宿主菌生长的影响，不受体内环境的限制，扩大了展示文库的库容量和分子多样性。优越性：优越性：3.目前还有很多研究表明，核糖体展示技术还能提高小分子抗体的稳定性，如三结构域抗体(VH/K)可以明显改进ScFv的稳定性。2.核糖体展示技术无需进行体内外系统转化，全程只需通过
8、PCR技术复制、扩增，使得其建库时间缩短，筛选简便。PCR技术还可引入突变，增加分子多样性，从而获得高亲和力抗体。我国单克隆抗体药物研发进展情况我国单克隆抗体药物研发进展情况近年来中国的单抗技术已经受到越来越多的关注和重视，单克隆抗体药物研究已被列入863计划和国家重点攻关项目计划和国家重点攻关项目。“十二五”期间，我国“重重大新药创制大新药创制”专项专项，中央财政下拨资金100亿元，配套资金300亿元。专项战略重点包括创新药物研究开发、药物大品种技术改造等。恶性肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、肺结核等10类重大疾病药物的研发是创制资金支持重点。目前，中国已经上市的抗体只有20多个
9、（截止到2010年7月），绝大多数在临床研究或已经上市的品种为完全仿制国外上市的产品,年销售约1亿美元，生产水平低、规模小，制约了单抗药物在中国的发展，我国政府和企业已经逐渐意识到抗体药物的安全性和有效性以及巨大的市场效益，在抗体新靶标发现、抗体大规模表达等产业化等方面发展迅速，投入逐渐增加，有望在510年内达到国际先进水平。“十二五”和“十三五”是我国抗体产业发展的黄金期，到了“十三五”期间，目前居全球前十位的抗体药物基本都能在我国实现产业化生产。目前，我国的单克隆抗体产业已经形成了以北京、上海、西安以及武汉等产业化基地。而单克隆抗体也发展到了第四代，我国已经上市的单抗药物多为鼠源性，正在研
10、究中的多为嵌合或者人源化单抗，而全人源单抗还没有。而在全球的单克隆抗体市场，全人源化单克隆抗体是其未来的发展方向。在FDA批准上市的80多种基因工程和抗体工程产品中，抗 体类产品有26种，其中18种为人源化抗体。国内准备或已涉足单抗产业的上市公司有中信国健、百泰生物、华神集团、丽珠集团、复星医药、双鹭药业、国药一致、海正药业、独一味、沃森生物等。中信国健、百泰生物更是国内这一行业的佼佼者。中信国健依托丰富产品线，是国内抗体药物领域领军者；百泰生物引进古巴先进技术，打造了我国首个人源化单抗“泰欣生”。国内已经获批生产的部分单抗产品国内已经获批生产的部分单抗产品公司名称商品名通用名适应症武汉生物制品研究所注射用抗人T细胞CD3鼠单抗器官移植排异东莞宏逸士生物技术药业抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏银屑病恩博克大连亚维药业抗人白细胞介素/8单克隆抗体乳膏银屑病上海中信国健药业益赛普注射用重组人型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白类风湿关节炎等上海美恩生物技术唯美生碘131I肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体注射液肝癌治疗百泰生物药业泰欣生尼妥珠单抗注射液结直肠癌上海赛金生物医药强克注射用重组人型肿瘤坏死因子受体/抗体融合蛋白强直性脊柱炎上海中信国健药业健尼哌重组抗CD25人源化单克隆抗体注射液抗移植排斥