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1、实验二 酶联免疫吸附测定BSA抗体效价1.1.目的要求目的要求(1)学习酶联免疫吸附测定的基本原理。(2)掌握酶联免疫吸附测定技术，抗体的效价测定及酶联免疫测定仪的使用。2.2.基本原理基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg 60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶-人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶-抗
2、体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。1974年 Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫标记技术免疫标记技术应用各种液相和固
3、相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定标记抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检观察或进行自动化测定荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术酶标技术戊二醛法，过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物（黄色，OD450)+H
4、2O图一直接型图一直接型Elisa 图二间接型图二间接型Elisa图三图三双抗体夹心型双抗体夹心型ELISA图四图四固相抗体竞争型固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）每次反应后都要反复洗涤？1.保证反应的定量反应2.防止重叠反应，引起非特异现象。Partially purified,inactivated HIV antigens antigens pre-coated onto an ELISA platePatient serum which contains antibodies.If the patient is HIV+,then this serum will c
5、ontain antibodies to HIV,and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme.This is the second antibody,and it binds to human antibodies.substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.HIV(human immu
6、nodeficiency virus)detectionpositivenegativeProtein protein interaction-ELISA1.Direct elisa different epitopeCoat with prey proteinIncubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein-2.Competitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentra
7、tion prey protein4.4.操作方法操作方法4.1 4.1 包包被被特特异异性性抗抗原原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Og/ml，每凹孔加100L，加盖置4过夜(37 2h)【已完成】次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液洗涤3次，首次洗涤静置2min后倾去，后两次静置1min。将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2 4.2 封封闭闭:每孔中加满封闭液（约300ul多），加盖或用封口膜封板，置37恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。4.3 4.3 加待加待测测血清血清(内含抗体内含抗体)、阴性血清、阴性血清(无抗体无抗体)及稀及稀释释液
8、液(PBS/Tween)PBS/Tween):待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释成1:100，取不同稀释度的待测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各1OOL加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37恒温箱1h，使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。12345678PBS/Tween1:100阴性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:50,0001:100,0001:500,000阳性血清4.4 4.4 加加酶酶标标抗抗体体:加入HRP-抗体(抗抗体，本实验中已经根据说明书稀释一千倍)，每孔加l00L，封板后置37温育lh，按上法至
9、少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。4.5 4.5 显显色色:首先按每10mLOPD应用液加入0.15mLH2O2处理。每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处530min。当显示明显黄色时应及时终止反应。4.6 4.6 终终止止反反应应:每孔加入10OL 2mol/L H2SO4。由黄色变为橙色。稳定35min即可比色测定。4.7 4.7 检测检测:用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对照、测波长为49Onm时各孔光吸收（A）。1.计算阳性血清与阴性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，当P/N2.1时为阳性，P/N2.1而1.5为可疑，
10、P/N1.5为阴性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗体效价。2.用“”“”表示，超过规定吸收值（0.20.4）的标本均属阳性。注意事项注意事项 (1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1100g之间，在偏碱条件下易吸附于反应板的凹孔中，4放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为0.02%NaN3，4贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存放3个月以上不影响测定效果。(2)反应各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。(3)为使显色反应便于比较，显色后置室温
11、暗处的时间应一致，终止反应35min后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。(4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性，否则无法结合。自动酶标仪（自动酶标仪（Elx800UVElx800UV）使用程序使用程序1 开机，进行System self-test2 按“DEFINE”键，进入“SELECT ASSAY NUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号（注：assay 01 为quick read，最大测试号为55）；按“ENTER”键修改测试的“NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single
12、或Dual）、波长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”键选择阅读方式(Auto或Manual)、阅读方向（Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起始位置（输入编号）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。3 按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数，打印机输出数据。4 按“MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。酶标板的清洗：酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗 免疫检测 灵敏度 辣根过氧化物酶：1020pg 碱性磷酸酶：1050pg 免疫金：125pg 125I:50100pg放射自显影术：将含放射性同位素置X感光胶片上感光，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带