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1、实验六抗体效价的Elisa测定第一页，讲稿共三十二页哦2.2.基本原理基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物的酶在免疫反应后，作用于厎物后显色，根据颜色的有无和深浅，定量测定Ab/Ag。免疫反应：一次或数次 具Ag,Ab特异的免疫学反应酶促反应：只进行一次 显示出生物放大作用，灵敏度ng,pg第二页，讲稿共三十二页哦 60年代初期，Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶-人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶-抗体，统称为酶标记物或酶结合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定第三页，讲稿共三十二页哦酶
2、联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称为Elisa)-是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面的优点。第四页，讲稿共三十二页哦1974年 Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原)，再与相应的酶标记物结合操作更方便，易重复灵敏度可高达ng（10-9g）至pg(10-12g)，第五页，讲稿共三十二页哦(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)第六页，讲稿共三十二页哦免疫标记技术免疫标记技术第七页，
3、讲稿共三十二页哦应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定标记抗体或抗原荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂镜检观察或进行自动化测定荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等直接在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究第八页，讲稿共三十二页哦酶-性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色，便于检测常用的酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horserad peroxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。酶标技术酶标技术第九页，讲稿共三十二页哦戊二醛法，过碘酸氧化法将酶与Ab
4、交联在一起Ag-Ab-抗Ab-HRPTMB+H2O2产物（黄色，OD450)+H2O第十页，讲稿共三十二页哦图一直接型图一直接型Elisa 第十一页，讲稿共三十二页哦图二间接型图二间接型Elisa第十二页，讲稿共三十二页哦图三图三 双抗体夹心型双抗体夹心型ELISA第十三页，讲稿共三十二页哦图四图四 固相抗体竞争型固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A（1）-A（2）第十四页，讲稿共三十二页哦每次反应后都要反复洗涤？1.保证反应的定量反应2.防止重叠反应，引起非特异现象。第十五页，讲稿共三十二页哦第十六页，讲稿共三十二页哦Partially purified,inactivated HIV a
5、ntigens antigens pre-coated onto an ELISA platePatient serum which contains antibodies.If the patient is HIV+,then this serum will contain antibodies to HIV,and those antibodies will bind to the HIV antigens on the plate.Anti-human immunoglobulin coupled to an enzyme.This is the second antibody,and
6、it binds to human antibodies.substrate which changes color when cleaved by the enzyme attached to the second antibody.HIV(human immunodeficiency virus)detection第十七页，讲稿共三十二页哦positivenegative第十八页，讲稿共三十二页哦第十九页，讲稿共三十二页哦Protein protein interaction-ELISA1.Direct elisa different epitopeCoat with prey prote
7、inIncubate with bait protein Pimary Ab anti bait protein-第二十页，讲稿共三十二页哦2.Competitive elisa same epitopeCoat with bait prIncubate with primary antibody anti bait pr and various concentration prey protein第二十一页，讲稿共三十二页哦第二十二页，讲稿共三十二页哦4.4.操作方法操作方法4.1 4.1 包包被被特特异异性性抗抗原原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Og/ml，每凹孔加100L，加盖
8、置4过夜(37 2h)【已完成】次日倾去凹孔内液体，用滴管取洗涤液在每孔中加满稀释/洗涤液洗涤3次，首次洗涤静置2min后倾去，后两次静置1min。将反应板扣放在滤纸上，以除净液体。4.2 4.2 封封闭闭:每孔中加满封闭液（约300ul多），加盖或用封口膜封板，置37恒温箱60min，倾去孔内液体，按上法洗涤3次。第二十三页，讲稿共三十二页哦4.3 4.3 加待加待测测血清血清(内含抗体内含抗体)、阴性血清、阴性血清(无抗体无抗体)及稀及稀释释液液(PBS/Tween)PBS/Tween):待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等)，阴性血清也稀释成1:100，取不同稀释度的待
9、测血清，阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各1OOL加至相应的凹孔中，加盖或封板，置37恒温箱1h，使抗体与固相抗原进行特异性结合，反复洗涤3次。第二十四页，讲稿共三十二页哦12345678PBS/Tween1:100阴性血清1:1,0001:5,0001:10,0001:50,0001:100,0001:500,000阳性血清第二十五页，讲稿共三十二页哦4.4 4.4 加加酶酶标标抗抗体体:加入HRP-抗体(抗抗体，本实验中已经根据说明书稀释一千倍)，每孔加l00L，封板后置37温育lh，按上法至少洗涤5次，最后用蒸馏水洗涤2次，扣在滤纸上吸干水分。4.5 4.5 显显色色:首先按每10
10、mLOPD应用液加入0.15mLH2O2处理。每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处530min。当显示明显黄色时应及时终止反应。4.6 4.6 终终止止反反应应:每孔加入10OL 2mol/L H2SO4。由黄色变为橙色。稳定35min即可比色测定。第二十六页，讲稿共三十二页哦4.7 4.7 检测检测:用酶联免疫测定仪，以PBS/Tween孔为对照、测波长为49Onm时各孔光吸收（A）。1.计算阳性血清与阴性血清A值之比(Positive/negative，P/N)，当P/N2.1时为阳性，P/N2.1而1.5为可疑，P/N1.5为阴性。用目测法则以较阴性对照深色的最高稀释度作为抗
11、体效价。2.用“”“”表示，超过规定吸收值（0.20.4）的标本均属阳性。第二十七页，讲稿共三十二页哦 注意事项注意事项 (1)聚苯乙烯微量反应板应选择高质量、非特异性吸附小的产品。包被物应具有较高的纯度，其浓度一般在1100g之间，在偏碱条件下易吸附于反应板的凹孔中，4放置过夜较理想，若暂时不用，可加入终浓度为0.02%NaN3，4贮存，也可倾去包被液，干燥后置硅胶干燥器中，室温存放3个月以上不影响测定效果。(2)反应各步均应充分洗涤，以除去残留物，减少非特异性吸附。为使结果重复应固定洗涤次数及放置时间，切忌相互污染。(3)为使显色反应便于比较，显色后置室温暗处的时间应一致，终止反应35mi
12、n后应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止时间。(4)待测抗体或抗原与酶标抗体应具有相同的免疫特异性，否则无法结合。第二十八页，讲稿共三十二页哦自动酶标仪（自动酶标仪（Elx800UVElx800UV）使用程序使用程序1 开机，进行System self-test2 按“DEFINE”键，进 入“SELECT ASSAY NUMBER”，用“NUMERIC”或“OPTION”键输入测试号（注：assay 01 为quick read，最大测试号为55）；按“ENTER”键修改测试的“NAME”；再按“ENTER”键进入下列菜单：按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或D
13、ual）、波长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、48孔或24孔)。按“MAP”键选择阅读方式(Auto或Manual)、阅读方向（Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起始位置（输入编号）、空白Map（Air、Full、Const、Column、P-Down、P-Across）。第二十九页，讲稿共三十二页哦 3 按“READ”键，酶标板推进入仪器，开始读数并计数，打印机输出数据。4 按“MAIN MENU”键回到主菜单，关闭电源。第三十页，讲稿共三十二页哦酶标板的清洗：酶标板的清洗：采用ELx50TM型微孔板洗板机，注射泵驱动的液体输送，条状单排清洗或全板清洗 第三十一页，讲稿共三十二页哦免疫检测 灵敏度 辣根过氧化物酶：1020pg 碱性磷酸酶：1050pg 免疫金：125pg 125I:50100pg放射自显影术：将含放射性同位素置X感光胶片上感光，随后经显影，定影，即可呈现出斑点或谱带第三十二页，讲稿共三十二页哦