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1、摘 要三重基序蛋白25 (Tripartite motif-containing protein 25, TRIM25) 在先天免疫反应中发挥重要作用。本实验通过在大黄鱼饲料中添加不同比例中草药复方（太子参、巴戟、当归、枸杞、茯苓、白术等），饲喂30天后，以大黄鱼肾脏组织为实验材料，通过实时荧光定量PCR技术分析饲喂中草药后TRIM25基因的相对表达变化。结果显示：与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降（E2组除外），E3组的表达量下降最多（81%），其次是E1组（68%），E5组的表达量比对照组升高654%，但是各组间均无显著性差异（P大于0.05）。本研究结果为中草药作
2、为饵料添加剂在大黄鱼饲料中的应用提供了基础数据，也为中草药作为鱼类免疫增强剂提供了前期研究基础。关键词：大黄鱼；太子参提取物；TRIM25Abstract TheThethreefoldmotifprotein25(Tripartitemotif-containingprotein25,TRIM25)playsanimportantroleininnateimmuneresponse.Inthisexperiment,byaddingdifferentproportionsofChineseherbalcompound(Radixpseudosciae,RadixMorindae,angeli
3、ca,wolfberry,Poria,Atractylodesmacrocephala)inlargeyellowcroakerfeed,30dayslater,thekidneytissueofPseudosciaenacroceawasusedasexperimentalmaterial.TherelativeexpressionofTRIM25geneafterfeedingChineseherbalmedicinewasanalyzedbyreal-timequantitativePCR.Resultsshowedthatcomparedwiththecontrolgroup,thee
4、xpressionofthegenedecreasedinalltheexperimentalgroups(exceptgroupE2),theexpressionlevelofE3groupdecreasedby81%,followedbyE1group(68%),andtheexpressionlevelofE5groupwas654%higherthanthatofcontrolgroup.Buttherewasnosignificantdifferenceamongallgroups(Pgreaterthan).ZeroPointZeroFiveThisstudyprovidesbas
5、icdatafortheapplicationofChineseherbalmedicineasfeedadditiveinlargeyellowcroakerfeed,andprovidesapreliminaryresearchbasisforChineseherbalmedicineasafishimmuneenhancer.Keywords: Pseudosciaena crocea；Pseudosciaenaheterophyllaextract；TRIM25；目录1引言11.1大黄鱼的生物学特性11.2 中草药在水产养殖中的应用11.3 TRIM25基因22材料和方法32.1 材料
6、、药品及仪器32.1.1 原料鱼处理32.1.2 试剂42.2 方法42.2.1 总RNA提取42.2.2 RNA凝胶电泳42.2.3 RNA定量分析52.2.4 RNA反转录53 实验结果及分析63.1 RNA的质量检测63.2熔解曲线分析73.3 基因表达分析84 讨 论84.1 中草药添加相关应用与前景84.2 中草药添加对TRIM25基因表达的影响94.3 总结10致 谢11参考文献12大黄鱼TRIM25基因在饵料中添加中草药后的表达变化1引言1.1大黄鱼的生物学特性大黄鱼（Larimichthys crocea）属鲈形目（Perciformes）、石首鱼科（Sciaenidae）、黄
7、鱼属（Larimichthys），在20世纪70年代前为我国近海四大渔捞对象之首，有我国海水国鱼之称，俗称大黄花，福建称黄瓜鱼，广东叫金龙，也有叫红口的Error! Reference source not found.。大黄鱼是暖温性鱼类，南到琼州海峡，北到山东半岛，都有大黄鱼生活。大黄鱼一年中有春、秋两季生殖的特点，根据纬度的不同，生殖洄游的月份也不同，从2月中旬到6月中旬都有鱼群洄游生殖，在渔业上形成春讯，9月份开始形成秋汛一直到12月Error! Reference source not found.。由于营养丰富、肉鲜味美，受到广大消费者的喜爱。大黄鱼被过量的捕捞，导致野生的大黄鱼越
8、发罕见。随着养殖技术的不断增强，在我国福建、浙江、广东等地区沿海大量人工养殖大黄鱼。据统计2018年的大黄鱼养殖总量为197980吨，其中福建省的养殖量就达到了165378吨Error! Reference source not found.。但是随着养殖规模不断扩大、养殖环境的恶化，大黄鱼的病害频发，每年给养殖户带来的经济损失都在增加，影响了产业的发展Error! Reference source not found.。因此，开发促进养殖水产动物生长、增强抗病能力的环保型饵料添加剂已成为水产养殖业的发展新趋势。1.2 中草药在水产养殖中的应用研究表明，中草药中蕴含的有效成分多种多样，它不但含
9、有生物体必需的糖类、氨基酸、维生素等物质，还含有生物体不易从食物中摄取到的有机酸、多糖、苷类、生物碱等多种免疫活性物质。这些中草药蕴含的有效成分不仅可以增强水生动物的新陈代谢功能，增进食欲，还可以加快催化物质和蛋白质的生成，加强养分的吸收利用，从而加快水产品的成长速度，降低饲料的浪费率。增强体质，降低水生动物因抗应激能力和免疫抵抗力低而死亡率，并提高水产品的质量。中草药具有许多功能：首先是促进生物体的生长发育。中草药通常含有维生素，脂肪，蛋白质，淀粉，微量营养素，糖，矿物质和其他营养素。生物体可通过体内代谢作用来增快成长速率6。其次是加强生物体的免疫系统。中草药中蕴含的生物活性多糖不仅可以增强
10、生物体的免疫能力，提高疾病抵抗力，还可以抵抗细菌和驱除昆虫，维护生物体的健康。简纪常等7-8用复合中草药添加基础饲料中饲养大黄鱼，结果表明复方中草药不仅增加了溶菌酶的活性，而且还增加了吞噬细胞的数量，研究表明复合中草药明显提高了水产品的非特性免疫功能。Fried等9研究表明人参水提物在体外能促进NO的合成，增强巨噬细胞的功能。第三是抗微生物作用。一些中草药蕴含的有效成分能直接影响病原体的代谢和结构，从而增强动物的抗菌能力。第四是抗应激作用。中草药增强了某些动物对外界有害刺激的防御能力。例如，在水生动物饲料中添加黄芪多糖可以增强抵抗疲劳和缺氧的能力。第五是复合作用。中草药配比遵循一定的规律，经过
11、许多中草药的复配，可以使其功效增强。因此，合理使用中草药不仅可以提高动物的抗病能力，提高机体免疫力，还可以减轻抗生素和化学药物引起的问题，如农业中的耐药性和药物残留。太子参为系孩儿参属的一种干燥块根。味甘、微苦；性平Error! Reference source not found.。它主要分布在浙江，福建和江苏等省，其中福建荣县已成为太子参的主要繁殖基地。 研究表明，太子参具有抗疲乏，降血脂，止咳抗菌，提高免疫力的作用Error! Reference source not found.。皂苷（Saponin）是苷元为三萜的一类糖苷，除了在陆地高等植物存在外，在海洋生物中也少许存在。作为重要的
12、化学成分，与体内限制性构象相比，由生物活性环肽形成的线性环肽对化学降解和酶解的耐受性更高Error! Reference source not found.。在小鼠研究中，太子参可以改善动物的免疫保护系统。如周逢芳等人的研究结果表明，太子参中的白茶水提取物可以通过改善非特异性免疫功能来增强小鼠的免疫功能。Error! Reference source not found.。水产动物中，目前常见将太子参作为饵料添加剂在虾和福瑞鲤中的研究。如张耀武等用黄芪、党参、等十余味中草药作为饲料添加剂，能有效提高罗氏沼虾的免疫功能Error! Reference source not found.。吴斌等研
13、究表明太子参多糖显著增强了福瑞鲤的非特异性免疫功能Error! Reference source not found.。而太子参作为饵料添加剂在大黄鱼中尚未见报道。 1.3 TRIM25基因鱼类免疫系统是负责抵挡病原体侵入和受感染后恢复的防御系统16。鱼类的免疫系统主要有三大类分别是相关组织器官、与免疫应答的相关细胞和B细胞免疫。鱼免疫构造器官含括头、肾、脾等，同时这些相应器官也产生免疫细胞，免疫细胞则囊括淋巴细胞以及多种吞噬细胞。鱼类的获得免疫的关键是适应性抗体的产生，而适应性抗体则要有相应过程形成并且记忆，所以认为获得免疫处于初期水平，而鱼类自身天然免疫在拮抗外界病害入侵时发挥关键作用17
14、,18。故而提升鱼类自身天然免疫对防御外来病害具有重大意义。三重基序蛋白25 (Tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)属于E3泛素连接酶家族, 在先天免疫反应中发挥重要作用Error! Reference source not found.。TRIM蛋白属于E3泛素连接酶RING域家族，参与许多生物学过程，包括凋亡，先天免疫应答，细胞分化和细胞周期调控20,21。近几年TRIM家族成员在鱼类中被研究, 在斑马鱼(Danio rerio)基因组中发现240种TRIM家族基因成员或类似TRIM基因22 , 其中包含鱼类特有的TRIM亚家族基因
15、fifinTRIM/ftr (Fish novel large multigene TRIM gene)。在大西洋鲑(Salmo salar)23、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)24和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)25等硬骨类中发现病毒和病毒模拟体poly(I:C)诱导TRIM25基因表达, 而且TRIM25基因在体外过表达可抑制病毒复制, 在培养的鱼类细胞中可以增强干扰素信号基因表达28。有研究表明TRIM5基因在体外过表达可抑制病毒复制，在培养的鱼类细胞中可加强干扰素表达。如杨莹等通过克隆石斑鱼TRIM25基因研究发现TRIM25基因的表达
16、量在SGIV病毒侵染前期有明显增高，并且当TRIM25基因过表达时能有效抑制该病毒的基因复制。郑健美等对罗尼罗非鱼TRIM25基因进行克隆分析表明当人工感染无乳链球菌后，TRIM25在各组织中表达量有显著上升。这些研究充分表明TRIM25基因可能在硬骨鱼类抗病毒免疫应答中发挥重要作用。 本论文研究将太子参等中草药添加到大黄鱼饲料中，研究饵料添加对大黄鱼TRIM25基因表达的影响，为中草药提高鱼类免疫研究提供基础数据和基本操作方法。2材料和方法2.1 材料、药品及仪器2.1.1 原料鱼处理实验所用大黄鱼来源于宁德市鼎诚水产有限公司自行繁育的健康、规格一致，平均体长（23.450.83）cm，体质
17、量（34.058.23）g的大黄鱼幼鱼。原料鱼共分六组饲养分别为：1、2、3、4、5、6（CK），养殖在1.5T养殖桶中，养殖周期30d，实验组饲料中添加的太子参及其他中草药浓度见表2-1。每组设置1个平行组，每组100尾大黄鱼幼鱼。每天分2次投喂鱼体质量1%2%的饲料，视摄食情况酌情调整。养殖水体水温控制在2426之间，溶解氧大于5.0mg/L，pH值维持在8.0左右，氨氮小于0.2mg/L。常规养殖管理，做好养殖记录。30天以后，每组分别随机取三尾健康个体进行活体解剖采样，取脾脏组织保存于Trizol裂解液，-80超低温冰箱保存备用。表2-1 实验组中草药的具体添加量Table 2-1 t
18、he specific amount of herbal medicine added in the experimental group组别组分用量（%）1太子参0.52太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天各0.167（总1.0）3太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天太子参0.5其他各0.1（总1.0）4太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓各0.111（总1.0）5太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天、白术、当归、茯苓、太子参0.5其他各0.0625（总1.0）6商品饵料2.1.2 试剂SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real time）、rT
19、aq DNA Polymerase、购自大连宝生物公司。dNTP购自大连宝生物公司。DNA Marker购自北京博迈德科技发展有限公司。引物由上海生工生物公司合成。Trizol试剂购自生工。2.2 方法2.2.1 总RNA提取采用Trizol法进行RNA提取，提取方法参照说明书进行，具体如下：（1）取1.5 ml EP管加入30-50 mg脾脏样品，用移液枪加1 mL Trizol，冰上破碎成浆；常温放置3 min，412000g离心5 min。（2）取清液层加氯仿（1/5上清体积），混匀，常温等待5min，4 12000g离心5min。（3）取清液层加同体积经预冷后的异丙醇，混匀，-20放置
20、20 min，4 12000g离心10 min。取上清时需注意宁可少取也不要取到中层蛋白和下层基因组溶液，若取到则对后续RNA纯度品质造成污染。（4）倒清液层加1mL 75%乙醇（预冷），4 12000 g离心5 min，干燥（需干燥至EP管壁没有余存乙醇，若余下乙醇较多可以用灭菌过的枪头吸出，沉淀由实体转至渐透明之间，则干燥完全），加无核酸酶水20-30ul，-80保存。2.2.2 RNA凝胶电泳1.制胶：称取2.4g琼脂糖，加20 ml 1X TAE电炉加热溶解放凉加入2 L核酸染色剂，倒入制胶模具，待凝固成型。2.点样：将RNA样品与RNA Loading Buffer混好，将混好的RN
21、A样品点入胶孔中，设定程序121V，15 min，开始电泳。3.将电泳完成的胶用凝胶成像设备观察，验证其完整性。2.2.3 RNA定量分析将RNA样品用超微量分光光度(Thermo Scientific)测定样品在260和280nm的吸收值，记录RNA样品浓度。2.2.4 RNA反转录以RNA样品为模板，按照PrimeScriptIV 1st strand cDNA Synthesis Mix (Takara)试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成，总反应体系为10 L（如表2-2）。表2-2反转录各引物引物名称各引物含量（L）5Buffer2Enzyme Max 0.5OligdT0.5Ran
22、dom 6 mers0.5RNA1-3水加至10 Table 2-2 reverse transcription of each primer02.2.5 SYBR Green实时荧光定量PCR根据大黄鱼基因组数据库中的基因序列设计引物，以-actin作为内参基因(引物序列表2-3)，使用TB Green Premix Ex TaqTM (Takara)试剂盒对基因进行相对荧光定量PCR检测，每个反应设2个重复。12.5 L反应体系如下：6.25 L TB Green Premix ExTaqTM (TaKaRa)，正向和反向引物各0.5 l（2 M），1 L 稀释后的cDNA 模板（1:10
23、稀释），4.25 L水。循环参数：95 预变性 5 min，40 个循环：95 15 s，60 45 s。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。实验重复 2 次，以平均值进行后续数据分析。根据2-Ct方法计算出每个基因的相对表达量，所得数据用SPSS （Statistics Package for Social Science）18.0 进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），比较均值的差异显著性（P0.05）。表 2-3大黄鱼实时荧光定量PCR引物Tab.2-3 Primers used for real-time PCR analysis from L. crocea基因名称 正向
24、引物 反向引物gene nameforward primer reverse primer 谷胱甘肽还原酶GR AGCCAAAACAGCCGTGAT CGGCTAACATAAGCATCCC-actin TCGTCGGTCGTCCCAGGCAT ATGGCGTGGGGCAGAGCGT3 实验结果及分析3.1 RNA的质量检测通过琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测分析RNA的浓度和完整性。本实验得到的RNA，经过电泳以后，发现18s、28s条带清晰，无明显smear，说明RNA具有较高的完整性（图3-1）。RNA的OD值测定是检测RNA质量的重要指标，RNA的OD260/280在1.8-2.0之间，说
25、明其质量较好，完整性较高，若比值大于2.2说明RNA存在降解，比值小于1.8则可能存在污染。本实验获得的的OD260/280均值在1.7-2.1之间，（表3-1），说明提取的RNA质量较高，可满足后续实验的要求。图3-1 部分RNA电泳图Figure 3-1 partial RNA electrophoresis diagram表3-1RNA的定量结果Table 3-1 RNA Quantitative results样品编号OD260/280浓度（g/L）样品编号OD260/280浓度（g/L）Ki-E1-11.810.87Ki-E4-12.091.80Ki-E1-22.101.64Ki-E
26、4-22.121.50Ki-E1-32.061.30Ki-E4-32.101.02Ki-E2-11.911.41Ki-E5-11.931.40Ki-E2-22.051.24Ki-E5-22.031.33Ki-E2-32.031.41Ki-E5-32.031.21Ki-E3-12.011.33Ki-C12.031.12Ki-E3-21.901.44Ki-C22.021.55Ki-E3-32.091.72Ki-C31.931.30注：Ki（Kidney）为肾脏，E为实验组，C为对照组3.2熔解曲线分析实时定量PCR结合荧光染料的特性可直观的反应非特异性扩增，将特异性引物进行熔解曲线分析，熔解曲线呈
27、单峰（图），则说明引物特异性较好，定量结果准确。图3-2溶解曲线分析结果Figure 3-2 Results dissolution curve3.3 基因表达分析该基因在不同实验组中的相对表达情况如图3-3，结果显示，与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降（E2组除外），E3组的表达量下降最多（81%），其次是E5组（67%），E2组的表达量比对照组升高654%。图3-3基因相对表达量图Fig. 3-3 Relative gene expression4 讨 论4.1 中草药添加相关应用与前景中草药作为饲料添加剂，已逐步在水产养殖广泛应用，因为中草药作为饲料添加剂具有小的
28、毒副作用，药残和耐药性低下，效果明显，价廉等优势Error! Reference source not found.。赵倩等研究表明中草药提取物能够增强鲤鱼的溶菌酶活力，提高鲤鱼存活率Error! Reference source not found.；中草药中含有化合物，可以增强试验动物吞噬细胞活性，从而降低机体的受病害的几率Error! Reference source not found.。耿昕颖等研究表明醇提五倍子不但对嗜水气单胞菌引起的感染具有一定抵抗作用，还可以提高鳙鱼（Aristichtys nobilis）的非特异性免疫能力Error! Reference source not
29、 found.。在饲养环境恶化的今天，研究增强抗病能力的环保型饲料添加剂已成为水产养殖业的发展趋势。而天然中草药具有毒性低、耐受低等优点作为饵料添加剂拥有不可小觑的情景。4.2 中草药添加对TRIM25基因表达的影响目前的研究证据表明，鱼类和哺乳动物的分子功能和免疫力成分非常接近，但形态结构却存在显着差异。即使在鱼类本身中，由于物种和形式的多样性，其免疫器官及其结构也不相同。一般而言，鱼类的主要免疫器官是粘膜相关的淋巴样组织，脾脏和头部肾脏，但它们没有高级脊椎动物的淋巴结和骨髓Error! Reference source not found.。先天免疫反应是脊椎动物抵御微生物入侵的第一道防线
30、Error! Reference source not found.。三序基蛋白（TRIMs）是一个在细胞分化、先天免疫、细胞凋亡以及转录调节等多种生物学进程中有重要作用的蛋白家族。TRIM25蛋白是重要的干扰素诱导基因（ISGs）基因之一,在病毒感染过程中,TRIM25蛋白可以通过促进线粒体信号蛋白（MAVs）和维甲酸诱导基因I（RIG-I）的信号传递和相互作用诱导IFNs的转录和表达Error! Reference source not found.。在哺乳动物中研究表明，TRIM25 RING结构域具有泛素连接酶活性，能够促进下游靶蛋白发生泛素化修饰，调节其功能；同时，据报道TRIM25
31、参与了RIG-I所介导的抗病毒信号通路，促使RIG-I识别入侵病毒的RNA启动天然免疫应答，并诱导干扰素的产生从而抑制病毒的复制Error! Reference source not found.。研究表明TRIM蛋白与宿主防御密切相关，直接对抗病原菌，这种压力选择也促进TRIM蛋白的进化Error! Reference source not found.。本论文通过在基础饲料中添加中草药（太子参、党参、黄芪、甘草、枸杞、巴戟天）饲喂大黄鱼。通过分析基因的相对表达变化，率先分析太子参提取物对大黄鱼TRIM25基因表达的影响。不同实验组中的表达结果显示，大黄鱼在饲喂中草药后，TRIM25基因的表
32、达发生变化，除了E2组表达升高以外，其他组的表达均呈现不同程度的下降，尤其是E3组，下降的最大。4.3 总结从本次实验结果得出大黄鱼经中草药添加饲喂后，其肾脏中TRIM25基因表达的除E2组表达升高外，其他组的表达均呈现不同程度的降低，但组别之间并没有显著性差异。本实验的中草药组分复杂、剂量不单一，可能存在一定的排斥作用导致部分有效活性组分表达不出来。本实验研究是在基因表达层面上的分析，基因的功能最终要体现在蛋白质即酶活的水平，基因表达层面和蛋白表达层面的表达变化规律，或许会不一样，下一步的工作是要从酶活的水平上分析该基因及其他的抗氧化酶的活性变化。总之，中草药作为饵料添加剂可以提高水产动物的
33、免疫性能，但是考虑到生物体内复杂的生物学变化，本研究后续还有很多工作需要进行。致 谢光阴荏苒，本科的学习即将结束，四年的学习生活使我受益匪浅。经历大半年时间的磨砺，毕业论文终于完稿，回首大半年来收集、整理、思索、停滞、修改直至最终完成的过程，我得到了许多的关怀和帮助，现在要向他们表达我最诚挚的谢意。首先，我要深深感谢我的导师史晓丽老师。晓丽老师为人谦和，平易近人。在论文的选题、搜集资料和写作阶段，晓丽老师都倾注了极大的关怀和鼓励。在论文的写作过程中，每当我有所疑问，晓丽老师总会放下繁忙的工作，不厌其烦地指点我;在我初稿完成之后，晓丽老师又在百忙之中抽出空来对我的论文认真的批改，字字句句把关，提
34、出许多中肯的指导意见，使我在研究和写作过程中不致迷失方向。他严谨的治学之风和对事业的孜孜追求将影响和激励我的一生，他对我的关心和教诲我更将永远铭记。借此机会，我谨向晓丽老师致以深深地谢意。 其次，我还要感谢我的辅导员王楠楠老师、林宏宇老师这几年来对我的关心、帮助与支持;同时也感谢这三年来与我互勉互励的诸位同学，在各位同学的共同努力之下，我们始终拥有一个良好的生活环境和一个积极向上的学习氛围，能在这样一个团队中度过，是我极大的荣幸.同时也感谢钟李强、洪晓兰两位同学，他们以极大的热情，帮助我完成了第一手语料的收集，感谢他们对本文调查工作所提供的大力帮助与支持。我要感谢我的父母及家人，没有人比你们更
35、爱我，你们对我的关爱让我深深感受到了生活的美好，谢谢你们一直以来给予我的理解、鼓励和支持，你们是我不断取得进步的永恒动力。最后，我要感谢参与我论文评审和答辩的各位老师，他们给了我一个审视几年来学习成果的机会，让我能够明确今后的发展方向，他们对我的帮助是一笔无价的财富。我将在今后的工作、学习中加倍努力，以期能够取得更多成果回报他们、回报社会。再次感谢他们，祝他们一生幸福、安康!参考文献1朱元鼎，伍汉霖.福建鱼类志（下卷）M.福州：福建科技出版社，1985.2大黄鱼J.水产科技情报,1973(05):29-30.32019中国渔业统计年鉴J.世界农业,2020(03):2.4王小平. 闽东大黄鱼养
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