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1、摘 要谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内重要的氧化酶类之一。大黄鱼是我国重要的海水经济鱼类,也是宁德市的特色产业之一。本实验通过在大黄鱼饲料中添加不同比例的中草药复方(太子参巴戟当归枸杞茯苓白术),饲喂30天后，以脾脏组织为实验材料，采用实时荧光定量PCR技术分析饲喂中草药后GSH-Px基因的相对表达变化。结果显示：与对照组相比，各实验组中该基因的表达均出现了不同程度的下降(E5组除外)，E3组的表达量下降最多(43%)，其次是E1组(31%)，E5组的表达量比对照组升高19%，但是各组间均无显著性差异(P大于0.05)。本研究结果为中草药作为饵料添加剂在大黄鱼饲料中的应用提供了基础数
2、据，也为中草药作为鱼类免疫增强剂提供了前期研究基础。关键词：大黄鱼；基因表达；GSH-PxAbstractGlutathione peroxidase (GSH-Px) is one of the most important peroxidase enzymes in the body, which has an important effect on the innate immunity of fish. Larimichthys crocea is one of the most important economic fish in China and sea water is als
3、o one of the characteristic industry in Ningde. In this study, adding different proportion of Chinese herbal medicine compound were added in the feed of L. crocea (radix pseudostellariae, ba ji, angelica, medlar, poria cocos, atractylodes and so on). After feeding after 30 days, the spleen was isola
4、ted and extracted for RNA. The real-time fluorescent quantitative PCR was used to analyze the relative expression of GSH in different groups. The results showed that compared with the control group, the gene expression in each experiment group were decreased (with the exception of E5 group), and the
5、 expression of E3 group decreased most (43%), followed by E1 group (31%), the expression of E5 group amount higher than the control group was 19%, but there was no significant difference between groups (P is greater than 0.05). The results of this study was to Chinese herbal medicine as bait additiv
6、es provide basic data for the application in the Larimichthys crocea feed, also provides the Chinese herbal medicine as a fish immune enhancer prophase research foundation.Key words: Larimichthys crocea; Gene expression; GSH-Px目录1 引言11.1大黄鱼11.2中草药及太子参主要简介11.3 GSH-Px基因22 材料和方法32.1 材料药品及仪器32.1.1原料鱼处理3
7、2.1.2试剂42.2 方法42.2.1总RNA提取42.2.2 RNA凝胶电泳42.2.3 RNA定量分析52.2.4 RNA反转录52.2.5 SYBRGreen实时荧光定量PCR53 实验结果及分析63.1 RNA的质量检测63.2熔解曲线分析73.3基因表达分析74 讨 论84.1 中草药添加相关应用与前景84.2 中草药添加对GSH-Px基因表达的影响84.3 总结9参 考 文 献10致 谢12中草药添加对大黄鱼GSH-Px基因表达的影响1 引言1.1大黄鱼大黄鱼（Larimichthys crocea）辐鳍亚纲,鲈亚目,石首科,黄鱼属又称黄花鱼黄瓜鱼黄鱼等因体色金黄肉质细嫩营养丰富
8、,受到了广大消费者的喜爱,是我国近海洋经济鱼类之一1大黄鱼作为我国海洋鱼类的重要组成部分，有着最大规模的海水养殖基地。以宁德为代表，它是我国大型黄鱼产业的发源地，也是大黄鱼最大养殖基地。大黄鱼的养殖不仅促进了宁德当地的水产养殖业，还成为了闽东的支柱产业1986年大黄鱼人工繁殖技术获得重大突破，也标志着大黄鱼人工繁殖技术取得了长足的进步，带来了可观的经济效益。但由于环境污染和种植规模的不断扩大，近年来病害问题屡见不鲜，造成巨大损失。近年来，随着新鲜冰饵的长期投喂、养殖环境的变化、养殖规模的不断扩大、集约化水平的提高和饲养管理水平的落后，使得水产养殖的生长缓慢、病害频发、药物消耗和频度增加，我国水
9、产养殖业的健康发展整个养殖业受到了制约。因此，开发环境友好型饲料添加剂，促进水产养殖的生长，增强抗病能力，已成为水产养殖业发展的新趋势1-31.2中草药及太子参主要简介中草药的一些特点决定了它在鱼病防治运用中占据优势。特点一：中草药资源丰富且加工步骤简单。在中草药资源方面，我国有垄断优势。中国是中草药的发源地，目前约有1.2万种药用植物，同时中草药加工的步骤和使用方式比较简单。特点二：它可以和生态环境友好和谐相处。因为它是天然药品,比较容易被鱼类所吸收以及排出,这也避免了对鱼类造成二次伤害，一定程度上保护鱼产品质量不受影响。第三，中草药产生的毒副作用比较小。相对于化学品而言，中草药本身的毒性要
10、低得多。对于现阶段中草药的鱼病防治的实践而言,并没有形成鱼类抗药性的问题，因此可以进行适当地应用。第四，中草药具有抗应激作用，部分中草药可以提高动物对有害外部刺激的防御能力，如在水生动物铜中添加黄芪多糖，可以增强抗缺氧、抗疲劳的抗应激能力。”Rebca等试验结果表明，不同脂肪含量和不同成熟度淀粉对比目鱼仔鱼的生长没有显著影响，但在NH急性应激试验中，低脂肪含量和低淀粉成熟度加热对比目鱼仔鱼的累积死亡率有显著影响显著高于其他治疗组（P0.05）。因此，合理使用中草药免疫增强剂，不仅可以缓解化学药物和抗生素引起的耐药性和育种药物残留，而且可以提高机体免疫力和动物的抗病能力，中草药作为水生动物兔病促
11、进剂的研究越来越受到水产养殖界的重视。太子参是孩儿参属的一种干燥块根，又称双批七童参等。味甘、微苦、性平4。太子参作为一种珍贵的中草药，其公认的功效一个是益气健脾，临床中主要用于功能性消化不良的，身上乏力、食欲纳差，看着食物没有胃口。还有一个是长期久病的人，身体虚弱，用它来补益气血，主要是补气。另一方面，太子参还有益气生津的作用，用来补脾肺之精气。患者主要表现为口干、口燥、津液不足的症状，临床中用太子参来益气生津。还有其他作用:磷脂能提高免疫功能，保护细胞完整，降低血脂，健脑，预防脑血管疾病5太子参多糖的主要成分是蔗糖、槐糖、麦芽糖、php-a和php-b，它们对不同栽培方法和产地的太子参多糖
12、含量有很大影响。研究表明，太子参的含糖量在79月份较高，且随着贮藏时间的延长，太子参多糖含量会逐渐降低。其中福建省柘荣县栽培的品种多糖含量最高。皂甙由皂甙元和糖组成，它们在陆地上的高等植物中很常见，也存在于一些海洋生物中。它具有良好的生物活性，主要包括皂苷A、-胡萝卜苷尖叶丝石竹皂苷D。迄今为止，已发现16种多肽，它们是其组成中的关键化学成分。与线性环肽相比，生物活性环肽具有更好的抗酶和抗化学降解能力6。太子参块根不仅含有多糖、皂苷、环肽类还富含多种人体必需微量元素，例如FeCuZnMn,还有人体必需氨基酸其中以天冬氨酸谷氨酸精氨酸的含量较高7。此外，它还含有多种挥发油和磷脂。在对小鼠和猪的研
13、究中发现，太子参可以提高机体的免疫保护作用8-13。例如吴建华等连续7天饲喂每公斤仔猪体重为0.5克的太子参。研究表明，太子参可增加仔猪血液中白细胞数量，延长猪瘟抗体存在时间，有效提高抗体水平。孙碧等设计人参多糖对小鼠心肌缺血再灌注损伤的实验，发现人参多糖能有效减轻心肌结构损伤，调节心肌细胞凋亡在水生动物中，在南美白虾和鲤鱼中添加太子参作为诱饵是很常见的。据王芸等14报道，饲喂复方中草药可有效提高南美白对虾的抗病能力，并可随着饲喂时间的延长而不断提高其抗病能力。李义等15采用黄芪等多种中草药作为饵料添加剂,能有效提高罗氏沼虾的免疫功能。吴斌16将不同质量比例(0.1%0.2%0.3%0.5%)
14、太子参多糖做饵料添加剂饲养福瑞理发现在0.3%太子参多糖添加量下，福瑞理自身天然免疫系统得到明显改善。然而，作为一种食品添加剂，大黄鱼中的太子参还没有报道。1.3 GSH-Px基因谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)于1957年由Mills从牛红细胞中发现, 分子结构中含硒，故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px)，GSH-Px是广泛存在于机体内的重要过氧化物分解酶之一，能够把机体内的还原性GSH催化成氧化型GSH。谷胱甘肽过氧化物酶具有以下主要功能：（1）在机体内起到消毒作用。可以将体内的H2O2转化为H2O，也可以把脂质过氧化物还原为RO
15、H17，从而在体内起到消毒作用（2）降低有机氢过氧化物对机体的损害。在生物体处于病理状态的时候，有机氢过氧化物可破坏细胞膜，GSH-Px可以通过转化过氧化物来降低其对机体的损害。（3）作为一种抗氧化酶，GSH-Px通常与SODCAT等协同作用,不仅能维持机体内正常的氧化还原水平18-19,还能作为鱼类受污染物胁迫时机体产生的氧化压力的指示剂20-21。(4)调节前列腺素的合成。GSH-Px可以通过将前列腺素转化为无活性物质参与到前列腺素的合成中。（5）其他作用。硒和GSH系统在氧化防御反应中起到关键作用，GSH在代谢细胞信号传导和蛋白质相互作用中也具有辅助性功能,还可以调节机体防御反应，例如：
16、可以预防过亚硝酸盐的生产，进一步保护细胞不受亚硝酸盐的损伤。本论文以大黄鱼为研究对象，尝试将以太子参为主的中草药作为饵料添加剂应用在大黄鱼饲料中，通过分析比较大黄鱼体内不同组织间过氧化氢酶基因相对表达的变化，在一定水平上分析中草药添加剂对大黄鱼抗氧化酶系的影响，也为中草药影响鱼类免疫的研究提供基础数据。2材料和方法2.1 材料药品及仪器2.1.1原料鱼处理本试验所用大黄鱼为宁德鼎城水产有限公司幼年黄鱼，体长（23.450.83）cm，体重（34.058.23）g，健康，规格相同。原料鱼共分六组饲养分别为:123456(CK),养殖在1.5T养殖桶中,养殖周期30 d，实验组饲料中添加的太子参及
17、其他中草药浓度见表2-1。每组设置1个平行组。每组100尾大黄鱼幼鱼每天分2次投喂鱼体质量1%2%的饲料，根据食物摄入量做适当调整。养殖水体水温控制在2426之间，溶解氧大m于5.0g/L，pH值维持在8.0左右，氨氮小于0.2mg/L。常规养殖管理，做好养殖记录。30天后，每组分别随机抽取三尾健康个体进行活体解剖采样，取脾脏组织保存于Trizol裂解液，-80超低温冰箱中保存备用。表2-1实验鱼各组饲料用料组成组别组分用量(%)1太子参0.52太子参党参黄芪甘草枸杞巴戟天各0.167(总1.0)3太子参党参黄芪甘草枸杞巴戟天太子参0.5其他各0.1(总1.0)4太子参党参黄芪甘草枸杞巴戟天白
18、术当归茯苓各0.111(总1.0)5太子参党参黄芪甘草枸杞巴戟天白术当归茯苓太子参0.5其他各0.0625(总1.0)6正常的商品化饵料(CK)2.1.2试剂SYBR Premix Ex Taq(Perfect Rea ltime)rTaq DNA Polymerase购自大连宝生物公司dNTP购自大连宝生物公司。DNA Marker购自北京博迈德科技发展有限公司。引物由上海生工生物公司合成。Trizol试剂购自生工。2.2 方法2.2.1总RNA提取Trizol法提取RNA具体流程参照说明书,具体如下:(1)取1.5ml EP管加入30-50 mg脾脏样品,用移液枪加1mL Trizol,冰
19、上破碎成浆;常温放置3 min ,4 12000g离心5 min(2)取清液层加氯仿(1/5上清体积),混匀,常温等待5 min,412000 g离心5 min(3)取清液层加同体积经预冷后的异丙醇,混匀,-20放置20 min,4 12000 g离心10 min取上清时需注意宁可少取也不要取到中层蛋白和下层基因组溶液,若取到则对后续RNA纯度品质造成污染(4)倒清液层加1mL75%乙醇(预冷),4，12000 g离心5 min,干燥(需干燥至EP管壁没有余存乙醇,若余下乙醇较多可以用灭菌过的枪头吸出,沉淀由实体转至渐透明之间,则干燥完全),加无核酸酶水20-30 l，-80保存2.2.2RN
20、A凝胶电泳1.制胶:称取4.8 g琼脂糖,加入40 ml 1 X TAE，用电炉加热溶解，放凉加入4 l核酸染色剂,倒入制胶模具,待凝固成型2.点样:将RNA样品顺离与RNA Loading Buffer混好,将混好的RNA样品点入胶孔中,设定程序121V，15 min,开始电泳3.将电泳完成的胶用凝胶成像系统观察,验证其完整性2.2.3 RNA定量分析将RNA样品用超微量分光光度计(Thermo Scientific)测定样品在260和280 nm的吸收值，记录RNA样品浓度2.2.4 RNA反转录以RNA样品为模板,按照Prime Script IV 1st strand cDNA Syn
21、thesis Mix(Takara)试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成,总反应体系为10 L(如表2-2)表2-2反转录体系Table 2-2 The volume of RT名称用量(L)5Buffer2EnzymeMax 0.5OligdT0.5Random6mersRNA水0.51-3补至102.2.5 实时荧光定量PCR根据大黄鱼基因组数据库中的基因序列设计引物,以-actin为内参基因(引物序列见表2-3),使用TB Green PremixExTaqTM (Takara)试剂盒,对基因进行相对荧光定量PCR检测,每个反应设2个重复。12.5 L反应体系如下:6.25 L TB G
22、reen Premix Ex TaqTM (TaKaRa)，正向和反向引物各0.5 L (2M),1l稀释后的cDNA 模板(1:10稀释),4.25 l 水。循环参数:95预变性 5 min，40 个循环：95 ，15 s,60 ，45 s。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析。实验重复 2 次,以平均值进行后续数据分析。根据2-Ct 算法算出每个基因的相对表达量，所得数据用SPSS18.0 进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),比较均值的差异显著性(P0.05)3-3基因相对表达量4 讨 论4.1 中草药添加相关应用与前景中草药乃我泱泱中华之瑰宝,不仅拥有丰富的营养组分，还有许多
23、珍贵的生物活性物质。中草药作饵料添加能提高生物机体的自身天然免疫促进机体生长。吴斌将不同质量比例(0.1%0.2%0.3%0.5%)太子参多糖做饵料添加剂饲养福瑞理发现在0.3%太子参多糖添加量下，福瑞理自身天然免疫得到显著提高。吴建华等以小猪体重每kg给0.5g太子参须连续喂养7 d，研究表明太子参须可以使小猪血液中白细胞数目增多，还对猪瘟的抗体存在时间有所延长，抗体水平也有效提升。在饲养环境恶化的今天,研究增强抗病能力的环保型饲料添加剂已成为水产养殖业的发展趋势。而天然中草药具有毒性低耐受低等优点作为饵料添加剂拥有不可小觑的情景。4.2 中草药添加对GSH-Px基因表达的影响中草药作为饲料
24、添加可有效提高机体自身天然免疫，其含有很多活性抗氧化物质可抑制防止生物体内不稳定自由基造成体内结构遭到破坏，另一方面中草药所含有效成分可提高机体内其他抗氧化物的活性。邹云等介绍了中草药多糖不同渠道作用机理，其中表明中草药多糖对干扰素补体系统等起激活作用。中草药从多渠道多方面综合提高了机体的免疫能力。谷胱甘肽过氧化物酶与过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶类和小分子抗氧化物质(如维生素 C 等)一起构成抗氧化系统22，共同作用于体内氧化还原反应产生的大量氧自由基,如超氧阴离子(O- )、羟自由基(OH)和过氧化氢(H2O2)，以维持体内氧化还原平衡，防止氧自由基损伤细胞膜和遗传物质23-32。谷
25、胱甘肽过氧化物酶主要分布在细胞的胞浆内，能及时清除细胞内适当过量的氧自由基，维持细胞内环境的氧化还原态的稳定，并且参与水生动物天然免疫,发挥重要的生理功能33。在本论文通过在在基础饲料中添加太子参等中草药(太子参党参黄芪甘草枸杞巴戟天)。饲喂大黄鱼，通过分析基因的相对表达变化，率先分析中草药对GSH-Px基因表达的影响。不同实验组中的表达结果显示，大黄鱼在饲喂中草药后，GSH-Px基因的表达发生变化，除了E5组表达升高以外，其他组的表达均呈现不同程度的下降，尤其是E3组下降的最大。这可能是由于中草药药性较慢，需要较长时间才能提高机体抗氧化能力，本实验的喂养周期为30 d，这个周期或许对提高机体
26、的抗氧化能力的影响不显著。E5组下，GSH-Px的表达稍微提高，说明这个组分的配方在30 d时对GSH-Px的活性有一定的诱导作用，但是后续还需要更多的工作辅佐去证实本研究的结果。4.3 总结本实验通过在大黄鱼饵料中添加一定剂量的中草药，从基因表达的层面分析了脾脏中GSH-Px基因在各个实验组和对照组中的表达变化，研究结果丰富了中草药引起大黄鱼基因表达变化的基础数据，也为在分子水平上解析中草药提高大黄鱼的生长存活率提供了理论基础。鉴于本实验只是在基因表达层面上进行研究分析，而基因的功能最终主要体现在蛋白质即酶活的水平，基因表达层面和蛋白表达层面的表达变化规律可能会有所不同，下一步的工作是要从酶
27、活的水平上分析该基因及其他的抗氧化酶的活性变化。之后的实验研究中我们还是要控制各种变量的准确程度以及精确性。寻找出更为有效的实验数据，为日后的继续研究或后人的实验提供更好的基础。参 考 文 献1 张彩兰.福建省大黄鱼养殖现状分析与对策N.上海水产大学学报,2002-3(1).2 曹俊明,许丹丹,黄燕华.饲料中添加核苷酸对凡纳滨对虾幼虾生长组织生化组成及非特异性免疫功能的影响J.水产学报,2011,35(4):594-603.3 柯巧珍,余训凯,张永兴.饲料中添加胜肽和益生菌对大黄鱼生长性能和体组成的影响J. 应用海洋学学报,2018,37(1):141-145.4中国科学院中国植物志编辑委员会
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29、in flammation and oxidative stress in RAW64.7 macrophages by suppressing the PI3K/Akt pathways J.Molecules, 2018,23(4):717.10 孙弼,宛蕾,林晓坚.太子参多糖对缺血再灌注损伤模型大鼠心肌细胞凋亡的抑制作用研究J.中国药房,2018(16):2175-2179.11 吴建华,杨荣平,张炎达,等.太子参须对仔猪免疫系统调理作用的研究J.福建畜牧兽医,2018,40(5):1-3.12 陈凌锋,蔡旭滨,檀新珠.太子参茎叶多糖对断奶仔猪肠道免疫功能肠黏膜形态结构及盲肠内容物菌群的
30、影响J.动物营养学报,2017,29(3):1012-1020.13 蔡旭滨,陈凌锋,檀新珠,等.太子参茎叶多糖对断奶仔猪生长性能和血清抗氧化指标免疫指标及生化指标的影响J.动物营养学报, 2016,28(12):3867-3874.14 王芸.复方中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响N.中国农学通报2012-28(29)15 姚勇,邢华.太子参在水产动物养殖中的应用初报J.中国水产,2005(6):82.16 吴斌.太子参多糖对福瑞鲤部分非特异性免疫功能和抗病力的影响J.福建农业学报,2017,32(5):481-485.17LennarzWJLaneMD.Encyclopedia
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38、心情久久不能平静。 伟人、名人为我所崇拜，可是我更急切地要把我的敬意和赞美献给一位平凡的人，我的导师。我不是您最出色的学生，而您却是我最尊敬的老师。您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的精神氛围。授人以鱼不如授人以渔，置身其间，耳濡目染，潜移默化，使我不仅接受了全新的思想观念，而且领会了基本的思考方式，从论文题目的选定到论文写作的指导,经由您悉心的点拨,再经思考后的领悟,常常让我“山重水复疑无路,柳暗花明又一村”。感谢我的爸爸妈妈，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚谢意! 同时也感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境。最后再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友和同学，以及在设计中被我引用或参考的论著的作者。12