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1、第第2 2章章 细胞工程细胞工程 第2节 动物细胞工程1.阐明动物细胞融合技术的概念、过程与意义,并与植物体细胞杂交过程进行比较,提升科学思维能力。2.通过分析单克隆抗体制备过程示意图,概述单克隆抗体制备的原理、过程,探讨单克隆抗体的优点及应用,认同动物细胞融合技术在医疗卫生等方面发挥了重要作用。学习目标二 动物细胞融合技术与单克隆抗体意义意义：打破生殖隔离打破生殖隔离，实现远缘杂交育种实现远缘杂交育种，培育新的作物类型。，培育新的作物类型。植物体细胞杂植物体细胞杂交技术交技术植物细胞植物细胞融合完成融合完成的的标志标志：杂种细胞杂种细胞再生出再生出新的细胞壁。新的细胞壁。植物体细胞植物体细胞
2、杂交技术完成杂交技术完成的的标志标志：形成：形成杂种植株杂种植株。有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？2.2 动物细胞融合技术与单克隆抗体动物细胞融合技术一、动物细胞融合技术1.概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.原理：细胞膜具有一定的流动性3.结果：形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞。4.融合方法：动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。与植物原生质体融合的方法相同物理法电融合法、离心法化学法聚乙二醇（PEG）融合法生物法灭活病毒诱导法（动物细胞融合特有）灭活是指用物理或是指用物
3、理或化学手段化学手段使病毒失去感染能力，但是，但是并不破坏病毒的抗并不破坏病毒的抗原结构。原结构。细胞膜上的细胞膜上的蛋白质分子和和脂质分子重新排布重新排布动物细胞融合完成的标志:形成具有单核的杂交细胞课本P48一、动物细胞融合技术5.意义：6.应用：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导方法结果7.植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞的全能性植物细胞的全能性细胞膜的流
4、动性细胞膜的流动性用果胶酶和纤维素酶用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散分散成单个细胞成单个细胞物理法、化学法物理法、化学法物理法、化学法、物理法、化学法、灭活病毒灭活病毒形成形成杂种植株杂种植株形成形成杂杂交交细胞细胞金版学案P55书本P49右上角问题：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。一、动物细胞融合技术一、概念检测1.1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（下列有关动物细胞融合与植物体
5、细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.B.都可以用电融合法或都可以用电融合法或PEGPEG融合法诱导融合融合法诱导融合C.C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株C课本P51金版学案P55课后练习：金版学案课时评价作业（八）：1-4；6在世界范围内，癌症患者的数量逐年递增（全球平均每年有75-80万人死于癌症），而且还呈现出年轻化的趋势。化疗过程中，由于化学药物没有特异性，因此必
6、然会杀死患者体内正常细胞，对患者身体健康造成较大的影响。目前，化学疗法是治疗癌症的常见手段，化疗的原理是借助一定药物，通过破坏细胞膜、阻断DNA的复制、干扰细胞内生长和增殖所需的信号传导通路等，促使癌细胞死亡。然而，化学疗法也会带来很大的副作用（如恶心、脱发、呕吐等），你能解释其中的原因吗？任务一：自主思考 结合所学，提供一种让该药物只作用于癌细胞而不伤及无辜的方案？（提示：癌细胞对于机体而言，充当的是什么角色？体内什么物质可与它特异性识别并结合呢？）抗体222222222222222增殖形成B淋巴细胞细胞群大量单一抗体单克 隆抗体2222222222222222单个B淋巴细胞体外培养 大量增
7、殖 第2章 细胞工程 动物细胞融合技术与单克隆抗体【问题1】如何制备能与肿瘤抗原特异性结合的抗体？【问题2】如何大量制备单一抗体？向动物反复注射肿瘤抗原使动物产生抗体从动物血清中分离所需抗体动物会接触多种天然抗原，因此体内产生的特异性抗体的种类超过百万种。一个B淋巴细胞B淋巴细胞群大量化学性质单一、特异性强的抗体克隆产生在体外培养条件下，一个B淋巴细胞不可能无限增殖每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。【问题3】如何突破这个障碍？如何获得既能产生特异性抗体，又能无限增殖的细胞呢？把B淋巴细胞与一种能无限增殖的细胞融合。产量低、纯度低、特异性差阅读课本P49第一段B细胞产生抗体骨髓瘤细胞能大量增
8、殖杂交细胞（杂交瘤细胞）既能产生抗体，又能大量增殖单克隆抗体动物细胞融合动物细胞培养 1975年，英国分子生物学家米尔斯坦与德国生物化学家科勒通过用绵羊红细胞免疫小鼠，从小鼠脾脏中提取B淋巴细胞，利用细胞融合技术，将其与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，从而获得了世界上第一株能稳定分泌特定抗体的杂交瘤细胞株。米尔斯坦和科勒也因此获得了1984年的诺贝尔生理学或医学奖。科勒是生理学或医学奖获得者中最年轻的一位，获奖时年仅38岁。米尔斯坦（Cesar Milstein）科勒（Georges J.F.Khler）课本P48-49结合课本P48-49图2-16:尝试构建制备单克隆抗体的流程B B淋巴细
9、胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交细胞杂交细胞融合二：单克隆抗体制备过程任务二：结合课本P48-49图2-16:尝试构建制备单克隆抗体的流程，并回答下列问题 给小鼠注射特定抗原目的？给小鼠注射特定抗原目的？诱导细胞融合的方法有几种？诱导细胞融合的方法有几种？诱导融合后的细胞类型？若仅考虑两两细胞融合呢？诱导融合后的细胞类型？若仅考虑两两细胞融合呢？得到大量单克隆抗体得到大量单克隆抗体哪两条途径？哪两条途径？杂交瘤细胞是如何筛选出来的？杂交瘤细胞是如何筛选出来的？有几次筛选过程？目的是什么？有几次筛选过程？目的是什么？注射特定的抗原（肿瘤抗原）培养骨髓瘤细胞从脾中提取骨髓瘤细胞诱导融合PEG融合
10、法、电融合法、灭活病毒诱导法多种杂交细胞：未融合的细胞B-B细胞、瘤-瘤细胞、B-瘤细胞杂交瘤细胞多种B淋巴细胞特点：既能无限增殖，又能产生抗体1、单克隆抗体的制备过程1.免疫处理2.诱导融合3.选择培养如何把杂交瘤细胞从众多的细胞中筛选出来?若只考虑细胞的两两融合，培养基中会存在几种细胞？课本P48-49二、单克隆抗体的制备过程在动物细胞培养液中加入氨基喋呤制成特定的选择培养基（HAT培养基），将诱导融合后的细胞接种到该培养基中。第一次筛选：筛选出杂交瘤细胞B淋巴细胞及同型融合细胞能合成DNA，但不能无限增殖死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能合成DNA，不能增殖死亡杂交瘤细胞能合成DNA，且能
11、无限增殖存活二、单克隆抗体的制备过程细胞细胞合成合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径途径能能被氨基喋呤阻断被氨基喋呤阻断。人人淋巴细胞中有这淋巴细胞中有这两种两种DNADNA的合成的合成途径途径，但，但不能分裂增殖不能分裂增殖。鼠骨髓瘤鼠骨髓瘤细胞中细胞中只有只有D D途径，没有途径，没有S S途径，但途径，但能不断分裂增殖能不断分裂增殖。多孔培养板常用工具【思考讨论思考讨论】5.5.如何筛选能如何筛选能分泌肿瘤抗体分泌肿瘤抗体的杂交瘤细胞？的杂交瘤细胞？1.1.怎样检测细胞是否能分泌肿瘤抗体怎样检测细胞是否能分泌肿瘤抗体？2.2.将所有细胞放在一起检测还
12、是分开将所有细胞放在一起检测还是分开成单个细胞检测？成单个细胞检测？回答问题加入抗原进行专一抗体检测。分成单个细胞分别检测。二、单克隆抗体的制备过程筛选出的杂交瘤细胞都能产生所需抗体吗？为什么？4.克隆化培养和抗体检测132如何筛选出能够分泌肿瘤抗体的杂交瘤细胞？96孔板二、单克隆抗体的制备过程课本P49稀释，加入到各孔中培养2122132112122ABCDEFG阳性孔稀释，加入到各孔中培养ABCDEFGABCDEFG1133331在各孔中加入肿瘤抗原在各孔中加入肿瘤抗原在各孔中加入肿瘤抗原31221222 111132133212331322124.克隆化培养和抗体检测单克隆抗体制备过程中
13、单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较两次筛选的比较项目项目第一次筛选第一次筛选第二次筛选第二次筛选筛选筛选原因原因目的目的 筛选筛选方法方法 筛筛选出选出杂交瘤细胞杂交瘤细胞筛选出筛选出能分泌所需抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞由于小鼠在生活中还受到由于小鼠在生活中还受到其他抗原的其他抗原的刺激刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有细胞中有能产生其他抗体的细胞能产生其他抗体的细胞用用特定的选择培养基特定的选择培养基筛选：筛选：未未融合融合的亲本细胞和融合的具有的亲本细胞和融合的具有同种核同种核的细胞都会的细胞都会死亡死亡，只有，只有融合的融合的杂交瘤细胞杂
14、交瘤细胞才能才能生长生长。用用9696孔板孔板培养，在每一个孔中尽量培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行行克隆化培养克隆化培养和和抗体检测抗体检测，经多次，经多次筛选得到足够数量的筛选得到足够数量的能分泌所需抗能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。体的杂交瘤细胞。诱导融合后得到的细胞中，除诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞杂交瘤细胞之外，还有之外，还有未融合未融合的亲本细胞的亲本细胞，也有，也有融合的具有融合的具有同种核的细胞同种核的细胞二、单克隆抗体的制备过程金版学案P56 点拨提升注射到腹腔内抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养体外大规模培养或注射到小
15、鼠腹腔内增殖单克隆抗体易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低，但规模小，产量少。从细胞培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体可大规模培养，大量生产，需要人为控制培养条件，成本相对较高。优点：特异性强灵敏度高可大量制备如何利用筛选出来的杂交瘤细胞获得大量单克隆抗体？课本P49二、单克隆抗体的制备过程从_小鼠的脾脏中提取_细胞小鼠_多种杂交细胞抗体检测呈_性的_细胞细胞融合选择培养_细胞_细胞单克隆抗体体外细胞培养_培养与抗体检测（可进行多次）从腹水中提取从培养液中提取第一次筛选：筛选出_细胞第二次筛选：筛选出_细胞_法、_和_法单克隆抗体制备过程运用了哪些技术？原理分别是什
16、么？已免疫B淋巴骨髓瘤PEG融合灭活病毒诱导电融合杂交瘤杂交瘤阳杂交瘤腹腔内分泌特异性抗体的杂交瘤克隆化动物细胞融合：细胞膜具有一定流动性动物细胞培养：细胞增殖二、单克隆抗体的制备过程金版学案P57【例【例3 3】下图是单克隆抗体制备流程的示意图】下图是单克隆抗体制备流程的示意图,下列有关叙述正确的是下列有关叙述正确的是 ()A.A.是从已免疫的小鼠脾中获得的是从已免疫的小鼠脾中获得的T T细胞细胞B.B.中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成C.C.同时具有脾细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性同时具有脾细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性D.D.是经筛选培养获得的能分泌所需抗体的
17、细胞是经筛选培养获得的能分泌所需抗体的细胞D金版学案P57应用到的技术？细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性多种杂交细胞及未融合的细胞小鼠骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞给小鼠注射特定抗原诱导诱导 融合融合提取提取第一次筛选第一次筛选 用特定的选择性培养基用特定的选择性培养基第二次筛选第二次筛选足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔体外培养大量单克隆抗体杂交瘤细胞（既能迅速大量增殖，又能产生抗体既能迅速大量增殖，又能产生抗体）（能产生抗体）（能产生抗体）（能无限增殖）（能无限增殖）从从腹水腹水中提取中提取从从培养液培养液中提取中提取克隆化培养、抗体检测克隆化培养、抗体检测（进行多次
18、筛选）（进行多次筛选）动物细胞融合动物细胞融合动物细胞培养动物细胞培养细胞增殖细胞增殖单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程原理？复习回顾271、诊断试剂最广泛应用抗原抗原-抗体杂交法抗体杂交法抗抗抗抗人绒毛促性腺激素人绒毛促性腺激素人绒毛促性腺激素人绒毛促性腺激素单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体在妊娠第在妊娠第8 8天就可以作出诊断，天就可以作出诊断，比原来诊断方法提前了比原来诊断方法提前了10d10d左右，左右，准确率在准确率在9090 以上。以上。具有准确、高效、简易、快速特点诊断优点：三、单克隆抗体的应用新冠病毒检测试剂课本P50细胞凋亡ADC被细胞吞噬ADC抗体药物接头抗体抗体
19、-药物偶联物药物偶联物(ADC)(ADC)，实现了对肿瘤细胞的，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤选择性杀伤 靶向运输药物靶向运输药物,即通过即通过特异性结合靶细胞表面的抗原特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的将连接的药物输送到靶细胞药物输送到靶细胞。思考：思考：ADCADC的的抗体抗体所发挥的所发挥的作用？作用？2015年，全球销售额排前十位的药物中，单克隆抗体药物就有5种。我国的单克隆抗体药物市场规模已达72亿元三、单克隆抗体的应用2、运载药物单克隆抗体+药物=“生物导弹”课本P501.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融
20、合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体CA课本P51练习与应用一、概念检测8.下图是制备乙型肝炎病毒表面抗体的流程,下列叙述正确的是()A.细胞表示多种T淋巴细胞B.原
21、生质体融合与过程均可用灭活病毒处理C.两次筛选均需进行专一抗体检验D.图中对小鼠的两次注射目的不同D小本P22第一次筛选的目的是得到杂交瘤细胞,不需要第一次注射的是抗原,第二次注射的是能产生专一抗体的杂交瘤细胞9.(2023广东)制备新型冠状病毒单克隆抗体的简要过程如下:给小鼠注射N蛋白(新型冠状病毒重要的标志蛋白)从脾脏中获取细胞诱导细胞与小鼠的细胞融合筛选出细胞克隆化培养和抗体检测,获得细胞。上述过程的细胞中,可能不具有增殖能力的是()A.细胞 B.细胞C.细胞 D.细胞小本P23A二、拓展应用 假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题?解决这些问题的大致思路是怎样的?这
22、样做会有什么风险?请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。提示：可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎，研究其发育机制，甚至可能培育出新的物种。但是，目前相关技术还不成熟，存在融合率低、胚胎死亡率高等问题，并且还可能带来一些伦理方面的问题。课本P51课后练习：金版学案课时评价作业（八）：5；7-16练习与应用知识小结：单克隆抗体的制备（1）该过程中应用到的技术_（2）原理_（3）注射特定抗原的目的_（4）诱导融合的方法_ 动物细胞特有的诱导融合方法为_动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B
23、淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法（5）第一次筛选的目的_ 第一次如何筛选_ 筛选原理_ _筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长（6）杂交瘤细胞的特点_（7）第二次筛选的目的_ 如何筛选_ _ 选择抗体检测呈_性的杂交瘤细胞，即_ _（8）抗体检测原理_获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）既能迅速大量增殖，又能产生抗体（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞_（10）如何获取单克隆抗体体外培养_小鼠腹腔内培养_（11）单克隆抗体的优点_在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳知识小结：单克隆抗体的制备（12）单克隆抗体的应用_运载药物、疾病诊断和病原体鉴定、作为药物治疗疾病