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1、2.2 动物细胞工程动物细胞培养1、动物细胞工程常用技术有哪些？基础技术是？、动物细胞工程常用技术有哪些？基础技术是？2、动物细胞培养的定义、原理、培养对象、目的？、动物细胞培养的定义、原理、培养对象、目的？3、动物细胞培养的条件？、动物细胞培养的条件？如何维持无菌、无毒环境？如何维持无菌、无毒环境？适宜的温度和适宜的温度和pH分别是多少？渗透压的影响因素？分别是多少？渗透压的影响因素？适宜的气体环境包括？分别有什么作用？如何维持？适宜的气体环境包括？分别有什么作用？如何维持？4、动物细胞培养流程？体外培养动物细胞的种类？、动物细胞培养流程？体外培养动物细胞的种类？5、细胞贴壁、接触抑制、原代
2、培养、传代培养的定义、细胞贴壁、接触抑制、原代培养、传代培养的定义6、动植物细胞培养的区别（原理、培养基种类、培养基特有成分、动植物细胞培养的区别（原理、培养基种类、培养基特有成分、培养结果、细胞来源、特点）和相同之处培养结果、细胞来源、特点）和相同之处7、干细胞的定义、种类、应用、干细胞的定义、种类、应用动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成动物细胞培养是指从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增单个细胞，然后在适宜的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。殖的技术。定义：细胞增殖细胞增殖原理：胚胎或幼龄动物细胞胚胎或幼龄动物细胞
3、培养对象：获得细胞或细胞产物获得细胞或细胞产物目的：一、动物细胞培养的条件营养条件营养条件其他条件其他条件动物细胞培养动物细胞培养所需的基本条件所需的基本条件糖类、氨基酸、无糖类、氨基酸、无机盐、维生素机盐、维生素无菌、无毒的环境无菌、无毒的环境适宜温度、适宜温度、pHpH、渗透压、渗透压适宜的气体环境适宜的气体环境1、营 养合成培养基：将细胞所需营养物质按种类和所需量严格配制而成的合成培养基：将细胞所需营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基，加入培养基，加入血清血清等一些天然成分。等一些天然成分。培养动物细胞一般使用培养动物细胞一般使用液体液体培养基，也称为培养基，也称为培养液培养液。培
4、养皿培养皿培养瓶培养瓶2、无菌、无毒的环境需要对培养液和所有培养需要对培养液和所有培养用具进行用具进行灭菌处理灭菌处理以及在以及在无无菌环境菌环境下进行操作。下进行操作。培养液还需要培养液还需要定期更换定期更换，以便清除代谢物，防止细胞以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成代谢物积累对细胞自身造成危害。危害。超净工作台超净工作台酒精灯火焰附近酒精灯火焰附近3、温度、pH和渗透压温度：温度：(36.50.5)pH：7.2 7.44、气体环境O2是细胞代谢所必需的是细胞代谢所必需的CO2的主要作用是的主要作用是维持培养液的维持培养液的pH。通常采用通常采用培养皿或松盖培养瓶培养皿或松盖培
5、养瓶，并将它们置于含有，并将它们置于含有95%空气和空气和5%CO2的的混合气体的混合气体的CO2培养箱中进行培养。培养箱中进行培养。二.动物细胞培养的过程取动物组织取动物组织制成细胞悬液制成细胞悬液转入培养液转入培养液原代培养原代培养转入转入CO2培养箱培养箱机械法机械法酶解法：酶解法：胰蛋白酶和胶原蛋白酶胰蛋白酶和胶原蛋白酶动物组织经过处动物组织经过处理后的初次培养理后的初次培养转入转入分瓶分瓶传代培养传代培养动物组织经过动物组织经过分瓶后的培养分瓶后的培养CO2培养箱培养箱贴壁细胞的收集：贴壁细胞的收集：悬浮培养细胞的收集：悬浮培养细胞的收集：离心法离心法胰蛋白酶等处理后离心胰蛋白酶等处
6、理后离心可以用胃蛋白酶在体外分散细胞吗？不可以；胃蛋白酶作用的适宜不可以；胃蛋白酶作用的适宜pH约为约为2，当，当pH大于大于6时，胃蛋白酶时，胃蛋白酶就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜就会失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为为7.2 7.4，胃蛋白酶在此，胃蛋白酶在此环境中没有活性。环境中没有活性。贴壁生长示意图贴壁生长示意图 接触抑制示意图接触抑制示意图培养瓶壁培养瓶壁1 1、能够、能够悬浮悬浮在培养液中生长增殖的细胞在培养液中生长增殖的细胞2 2、细胞贴壁的细胞、细胞贴壁的细胞当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增
7、殖（裂增殖（接触抑制接触抑制）悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻。营养物质缺乏等因素而分裂受阻。体外培养的动物细胞可以分为哪两类？比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基类型培养基特有成分培养结果细胞来源特点相同点植物细胞的全能性植物细胞的全能性细胞增殖细胞增殖液体培养基，合成培养基液体培养基，合成培养基固体培养基，天然培养基固体培养基，天然培养基植物激素、有机添加物（蔗糖）植物激素、有机添加物（蔗糖）血清、葡萄糖等血清、葡萄糖等新个体或大量细胞或细胞产品新个体或大量细胞或细胞产品细胞或
8、细胞产品细胞或细胞产品离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞胚胎或幼龄动物组织胚胎或幼龄动物组织1、分裂形成愈伤组织、分裂形成愈伤组织2、分化形成胚状体、分化形成胚状体1、只分裂不分化、只分裂不分化2、贴壁生长，接触抑制、贴壁生长，接触抑制无菌操作、适宜的环境、只进行有丝分裂无菌操作、适宜的环境、只进行有丝分裂三.干细胞培养及应用动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞动物和人体内仍保留的少数具有分裂和分化能力的细胞1.概念2.分布早期胚胎早期胚胎骨髓骨髓脐带血脐带血3.分类：发育阶段分：发育阶段分：胚胎干细胞（胚胎干细胞（ES干细胞）和成体干细胞干细胞）和成体干细胞成体
9、干细胞：成体干细胞：位于成体组织或器官内的干细胞。如位于成体组织或器官内的干细胞。如造血干细胞造血干细胞、神神经干细胞经干细胞、精原干细胞精原干细胞等。等。红细胞红细胞血小板血小板各类白细胞各类白细胞造血干细胞造血干细胞 成体干细胞具有组织特异性，只能在特定的组织中分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力。分化潜能分：分化潜能分：全能干细胞：胚胎干细胞全能干细胞：胚胎干细胞多能干细胞：脐带干细胞、胎盘干细胞多能干细胞：脐带干细胞、胎盘干细胞专能干细胞：神经干细胞、肌肉干细胞、专能干细胞：神经干细胞、肌肉干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞造血干细胞、脂肪干细胞诱导多能干细胞（iPS细胞）类
10、似于胚胎干细胞的一种细胞类似于胚胎干细胞的一种细胞iPS细胞多种体细胞定向诱导分化定向诱导分化体外诱导人的成纤维细胞白血病、帕金森病、阿而茨海默病等治疗治疗 诱导过程无须破坏胚胎，而且诱导过程无须破坏胚胎，而且iPS细胞可以来源于病人自身的体细细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，上可以避免免疫排斥反应，定向诱导分化定向诱导分化4.应用：通过造血干细胞的移植可以治疗白血病、遗传性血液病（如地中通过造血干细胞的移植可以治疗白血病、遗传性血液病（如地中海贫血、血液再生障碍性贫血、镰刀状细胞贫血）等疾病。海贫血、血液再生障碍性
11、贫血、镰刀状细胞贫血）等疾病。白血病是一类白血病是一类造血干细胞恶性克造血干细胞恶性克隆隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他非造血组织和器官，积，并浸润其他非造血组织和器官，同时抑制正常造血功能。临床可见不同时抑制正常造血功能。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。自体移植 科学家正在研究用胚胎干细胞治疗神经退行性疾病（如帕金森病、科
12、学家正在研究用胚胎干细胞治疗神经退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）、糖尿病、心肌坏死等疾病。阿尔茨海默病等）、糖尿病、心肌坏死等疾病。动物细胞融合技术与单克隆抗体抗体本质：本质：分布：分布：具有免疫功能的球蛋白具有免疫功能的球蛋白血清（主要），组织液及外分泌液血清（主要），组织液及外分泌液 灭活是指用物理或化学手段灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏其抗原结构。并不破坏其抗原结构。灭活、化学提纯灭活、化学提纯多种抗原多种抗原注射多种抗原注射多种抗原多克隆抗体多克隆抗体从血清中分离从血清中分离产量低特异性差病毒病毒如何抗体解决产量低和特异
13、性差的问题？恶性增殖的骨髓瘤细胞恶性增殖的骨髓瘤细胞产生抗体的产生抗体的B淋巴细胞淋巴细胞一.动物细胞融合技术 动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。个细胞的技术。1.概念：2.原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性3.方法：PEG融合法、电融合法融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法等等4.结果：形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞（杂形成具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞（杂交细胞）交细胞）突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤
14、和培育生物新品成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段；为制造种等的重要手段；为制造单克隆抗体单克隆抗体开辟新途径开辟新途径5.意义：二.单克隆抗体1.定义：单克隆抗体是由单一单克隆抗体是由单一B B细胞克隆产生的高度均一、仅细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体针对某一特定抗原表位的抗体二.单克隆抗体注射特定的抗原注射特定的抗原培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞多种多种B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导融合诱导融合将骨髓瘤细胞与将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合淋巴细胞融合2.过程：特定抗原免疫小鼠，从脾中获特定抗原免疫小鼠，从脾中获取产生取产生特定抗体的特定抗
15、体的B淋巴细胞淋巴细胞多种杂交细胞多种杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体既能迅速大量增殖，又能产生抗体)用特定的选择培养基进行用特定的选择培养基进行筛选筛选，除融合的杂交瘤细胞生长以外，除融合的杂交瘤细胞生长以外，其他细胞都会死亡其他细胞都会死亡96孔板，用于培养和筛选杂交瘤细胞将细胞培养液稀释后进行接种。每一个孔尽量只接种一个杂交瘤细胞多种杂交细胞多种杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体既能迅速大量增殖，又能产生抗体)抗体检测呈阳抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞性的杂交瘤细胞(分泌的抗体能分泌的抗体能与特定抗原结合与特定抗原结合)对上述经选择培养的
16、杂交对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次抗体检测，经多次筛选筛选，就可获得足够数量的能分就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。泌所需抗体的细胞。多种杂交细胞多种杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体既能迅速大量增殖，又能产生抗体)抗体检测呈阳抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞性的杂交瘤细胞将抗体检测呈阳性的杂交瘤细将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。或注射到小鼠腹腔内增殖。从细胞培养液或小鼠腹水从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体中获取大量的单克隆抗体小鼠腹腔
17、小鼠腹腔注射注射体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体思考第一次：用特定的选择培养基筛选得到杂交瘤细胞第一次：用特定的选择培养基筛选得到杂交瘤细胞第二次：用第二次：用96多孔培养皿培养得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞多孔培养皿培养得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞1、两次筛选的方法和目的分别是什么呢？2、单克隆抗体的优点？特异性强、灵敏度高、可大量制备特异性强、灵敏度高、可大量制备3.应用：1、生物导弹靶向运输药物治疗疾病 单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病，纯度高、特异性强，具有准确
18、、高效、简易、快速的优点。2、作为诊断试剂 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒早早孕诊断试剂盒”，再妊娠地再妊娠地8天就可以做出诊断，这笔原来的诊断提前了天就可以做出诊断，这笔原来的诊断提前了10d左右，可以避免左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在测的准确率在90%以上。以上。动物细胞融合植物体细胞杂交原理相关酶诱导手段诱导过程结果用途意义细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞的全能性细胞膜的流动性、植物
19、细胞的全能性胰蛋白酶，胶原蛋白酶胰蛋白酶，胶原蛋白酶纤维素酶，果胶酶纤维素酶，果胶酶杂交细胞杂交细胞杂种植物杂种植物培育新品种培育新品种克服了远缘杂交不亲和的障碍克服了远缘杂交不亲和的障碍使远缘杂交成为可能使远缘杂交成为可能制备单克隆抗体等制备单克隆抗体等动物体细胞核移植技术和克隆动物“（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，（悟空）拔一把毫毛，丢在口中嚼碎，望空喷去，叫一声望空喷去，叫一声变变!即变作三二百即变作三二百个小猴，周围攒簇。个小猴，周围攒簇。”这是西游记这是西游记中中的一段描述。的一段描述。动物细胞核移植技术我国自主培育的体细胞克隆牛我国自主培育的体细胞克隆牛定义：将动物一个细胞的细胞
20、核移入去核的卵母细胞中，使这个重新将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，进而发育成动物个体的技术。组合的细胞发育成新胚胎，进而发育成动物个体的技术。原理：动物细胞核的全能性动物细胞核的全能性生殖方式：无性生殖无性生殖分类：胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植使用设备从牛卵巢中使用设备从牛卵巢中采集卵母细胞，在体采集卵母细胞，在体外培养到外培养到M期期通过显微操作去核通过显微操作去核体细胞核移植的过程为什么要选处于为什么要选处于M期的卵母细胞期的卵母细胞作为受体细胞？作为受体细胞？使用设备从牛卵巢中使用设备从牛卵巢中采集卵母细胞，在体采集卵
21、母细胞，在体外培养到外培养到M期期通过显微操作去核通过显微操作去核高产奶牛（供体）高产奶牛（供体）取体细胞进行培养取体细胞进行培养将供体细胞注入去核的卵母细胞将供体细胞注入去核的卵母细胞通过电融合法使两细胞通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母融合，供体核进入卵母细胞，形成重构胚。细胞，形成重构胚。将胚胎移入受体（代孕）母牛体内将胚胎移入受体（代孕）母牛体内生出与供体奶牛遗传生出与供体奶牛遗传物质物质基本相同基本相同的牛犊的牛犊 重构胚是指人工重新构建的胚胎，重构胚是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。用物理或具有发育成完整个体的能力。用物理或化学方法（如电刺激、化学方法（如电刺
22、激、Ca2+载体、乙醇载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚，和蛋白酶合成抑制剂等）激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育进程。使其完成细胞分裂和发育进程。1为什么要选用处于为什么要选用处于M期的卵母细胞作为受期的卵母细胞作为受体细胞？体细胞？2将供体细胞整个注入去核卵细胞的原因？将供体细胞整个注入去核卵细胞的原因？3供体细胞一般用传代几代以内的细胞？供体细胞一般用传代几代以内的细胞？为为什么？什么？4、该进程还用了哪些技术？、该进程还用了哪些技术？治疗性克隆治疗性克隆体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题畜牧畜牧生产生产医药医药卫生卫生治疗治疗疾病疾病保护保护物种物种以患者作为供体培育以患者
23、作为供体培育人核移植胚胎干细胞人核移植胚胎干细胞转基因克隆动转基因克隆动物可以作为异物可以作为异种移植的供体种移植的供体保护濒危物种，保护濒危物种，增加存活数量增加存活数量克隆动物作为生物反克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白应器，生产医用蛋白加速家畜遗传改加速家畜遗传改良进程，促进优良进程，促进优良畜群繁育良畜群繁育1、干细胞技术、异种（如猪）器官抑制为解决器官移植问题、干细胞技术、异种（如猪）器官抑制为解决器官移植问题提供了新方法。下列相关叙述正确的是（多选）提供了新方法。下列相关叙述正确的是（多选）（）A、器官移植面临着移植供体的来源不足的困难、器官移植面临着移植供体的来源不足的困难B、
24、用患者自身干细胞治疗可避免异体移植产生免疫排斥、用患者自身干细胞治疗可避免异体移植产生免疫排斥C、以猪器官作异种器官来源时无需考虑其体内存在的病毒、以猪器官作异种器官来源时无需考虑其体内存在的病毒D、以病毒、以病毒DNA为载体将体细胞诱导成干细胞有潜在的风险为载体将体细胞诱导成干细胞有潜在的风险ABD2、关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是（、关于单克隆抗体，下列叙述不正确的是（）A、组成单克隆抗体的基本单位是氨基酸、组成单克隆抗体的基本单位是氨基酸B、单克隆抗体仅特异性地对同一抗原进行免疫反应、单克隆抗体仅特异性地对同一抗原进行免疫反应C、单克隆抗体的制备过程中，第一次筛选是为了选出能分、单克
25、隆抗体的制备过程中，第一次筛选是为了选出能分泌特定抗体的杂交瘤细胞泌特定抗体的杂交瘤细胞D、单克隆抗体可以广泛应用于疾病的诊断、治疗、单克隆抗体可以广泛应用于疾病的诊断、治疗E、利用同位素标记的单克隆抗体在特定组织中成像技术可以、利用同位素标记的单克隆抗体在特定组织中成像技术可以定位诊断肿瘤定位诊断肿瘤C3、根据体细胞核移植技术的特点进行推断，体细胞核移植技、根据体细胞核移植技术的特点进行推断，体细胞核移植技术可以用来（术可以用来（）A、有效提高濒危物种的遗传多样性、有效提高濒危物种的遗传多样性B、提高某些良种家畜的自然繁殖率、提高某些良种家畜的自然繁殖率C、解决人体器官移植供体来源短缺的问题、解决人体器官移植供体来源短缺的问题D、为科学研究提供实验动物、为科学研究提供实验动物E、构建转基因克隆动物，作为生物反应器，大规模生产珍贵、构建转基因克隆动物，作为生物反应器，大规模生产珍贵医用蛋白医用蛋白CDE